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（續(xù)）分批補料微型生物反應(yīng)器設(shè)計的最新進展

2023-02-01 22:48 作者:上海曼森生物 0人讀過 | 我要投稿

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公司專注于智能生物實驗室建設(shè)的整體解決方案服務(wù)，應(yīng)用于合成生物學(xué)、制藥、食品、CRO/CDMO、醫(yī)學(xué)檢驗等領(lǐng)域。提供需求分析、規(guī)劃設(shè)計、方案設(shè)計、產(chǎn)品開發(fā)、落地實施、3Q驗證、技術(shù)培訓(xùn)、流程再造等服務(wù)。

上期我們講到分批補料微型生物反應(yīng)器設(shè)計的內(nèi)部補料策略，本期將講述外部補料策略及結(jié)論，文章較長，建議關(guān)注保存！

目錄/CONTENT

01/介紹

02/內(nèi)部補料策略

? ? 1.擴散控制補料

? ? 2.酶控補料

? ? 3.內(nèi)部補料策略小結(jié)

03/外部補料策略

? ? 1.自動化液體處理系統(tǒng)

? ? 2.用于分批補料微生物反應(yīng)器系統(tǒng)的微流體和微型閥技術(shù)

? ? 3.外部補料策略小結(jié)

04/結(jié)論

PART

外部分批補料策略

03

在外部分批補料系統(tǒng)中，基質(zhì)從外部儲器補料。該策略的主要優(yōu)點是增加了靈活性和過程控制能力。然而，由于補料需要額外的基礎(chǔ)設(shè)施，外部分批補料系統(tǒng)固有地更復(fù)雜且操作成本更高。

3.1自動化液體處理系統(tǒng)

使用液體處理工作站可以實現(xiàn)高通量采樣以及向 MTP 或平行 MBR 中添加液體。例如，RoboLector?包括集成的 BioLector?（mp2-Labs，德國）MBR 篩選平臺。自動取樣編程為每 24 小時一次。補料和取樣均在不中斷搖動的情況下實現(xiàn)，從而最大限度地減少對氧氣傳輸?shù)母蓴_并防止細胞沉降，從而允許獲得代表性的樣品。與脈沖補料策略相關(guān)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是缺乏連續(xù)的補料供應(yīng)，這導(dǎo)致細胞代謝中的振蕩并限制與工業(yè)規(guī)模發(fā)酵的可比性，在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵中，指數(shù)補料策略更常用。Jansen 等人于 2019 年開發(fā)了一種自動反饋調(diào)節(jié)的基于酶的分批補料系統(tǒng)(FeedER)?？梢酝ㄟ^控制添加來實現(xiàn)定義的指數(shù)生長速率。

Ambr?平臺通過添加泵送液體管線，可以向每個單獨的反應(yīng)器中連續(xù)添加液體?？朔碎g歇補料的局限性，有利于實施連續(xù)補料方案和更嚴格的 pH 控制。

Bioreactor48 平臺（2mag，德國）與Freedom EVO(TECAN，瑞士) LHS 相結(jié)合，以實現(xiàn)分批補料和過程控制。Bioreactor通過 LHS 向含有 β-呋喃果糖苷酶的培養(yǎng)物間歇投加蔗糖，使可代謝的果糖和葡萄糖得以連續(xù)釋放。對間歇葡萄糖和酶促攝食策略的比較表明，生物量累積非常相似，但是，連續(xù)(酶促)攝食增強了 GFP 熒光。DO 振蕩在間歇補料培養(yǎng)物中顯著更大。

3.2 用于分批補料微生物反應(yīng)器系統(tǒng)的微流體和微型閥技術(shù)

與自動 LHS相關(guān)的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)是補料的間歇性。近來，微流體技術(shù)已經(jīng)被實施，其目的在于開發(fā)更精確的工業(yè)過程的按比例縮小模型。微流控生物反應(yīng)器系統(tǒng)涉及對小體積流體的受控操作。在 Mardanpour 和 Yaghmae 研究中，使用大腸桿菌作為生物催化劑，在微流控微生物燃料電池(MFC)中以分批補料模式從葡萄糖和尿素產(chǎn)生生物電。為了構(gòu)建微流控 MFC，使用具有單個微通道的聚甲基丙烯酸甲酯板作為主體，使用鎳基陽極和負載鉑的碳覆蓋陰極作為主體頂部和底部的電極，通過這種方式，親水性鎳表面吸收陽極電解液并促進細胞附著，從而促進生物膜的生長。為了確定最適合再現(xiàn)大型生物反應(yīng)器波動條件的微流體系統(tǒng)，Ho 等人比較了三種廣泛使用的微流體設(shè)計。該研究表明，微流體系統(tǒng)的設(shè)備設(shè)計在定量和靈敏地再現(xiàn)典型工業(yè)規(guī)模生物反應(yīng)器中的不均勻性方面起著關(guān) 鍵作用，可能會影響分批補料系統(tǒng)的工藝產(chǎn)率。

微流控FlowerPlate 技術(shù)最近被用于優(yōu)化谷氨酸棒桿菌的綠色熒光蛋白(GFP) 生產(chǎn)。Morschett 等人開發(fā)了一種高通量、并行化的 pH 控制分批補料培養(yǎng)工作流程，可在線監(jiān)測微孔板中的生物量、pH 值、DO 和熒光。每排的兩個容器中分別加入葡萄糖-尿素補料溶液和 3M 磷酸(單側(cè) pH 控制)。將具有不同補料策略(脈沖、恒定、指數(shù))的分批補料工藝與標準分批工藝進行了比較。商業(yè)微基質(zhì)(Applikon Biotechnology，荷蘭)平臺是一種接近連續(xù)補料的替代方法，這種方法便于通過微型閥對每種單獨的 μBR 進行獨立的液體添加。該最先進系統(tǒng)基于標準 24 孔深孔板，工作體積為 2–7mL，具有集成的熒光團 pH 和溶解氧傳感器，以及每個單獨孔的獨立氣體和液體添加量。

3.3 外部補料策略總結(jié)

具有自動外部補料和嚴格控制工藝參數(shù)的新型 MBR 技術(shù)的最新進展，使得能夠更接近地模擬工業(yè)規(guī)模的生物過程。通過自動化，實驗的吞吐量和精確度得到了顯著的提高。機器人 LHS 已證明了在微尺度下有效高通量分批補料培養(yǎng)的潛力。它們可以與現(xiàn)有硬件相結(jié)合，并易于編程，以實現(xiàn)廣泛的實驗應(yīng)用。通過安裝液體處理機器人和分析設(shè)備，對 Bioreactor 培養(yǎng)平臺進行了改造，實現(xiàn)了全自動受控分批補料培養(yǎng)，并具有自動取樣和在線樣本分析功能。Mühlmann 等人的一項研究也證明了 RoboLector?平臺的適應(yīng)性，為了實現(xiàn)自動補料培養(yǎng)基制備和細胞培養(yǎng)，安裝了額外的冷卻器、加熱器搖動器和真空站。移液操作可以預(yù)先編程以執(zhí)行定義的補料配置文件并以高精度重復(fù)多次。LHS 補料的另一個限制是它的間歇性。微流體設(shè)備提供連續(xù)的補料供應(yīng)，以更接近地代表工業(yè)規(guī)模條件?？梢允褂梦⒘黧w裝置分配小體積，使得它們對單個細胞的研究特別有吸引力。由于對分離細胞的研究允許將細胞內(nèi)效應(yīng)與細胞間或群體效應(yīng)區(qū)分開來，因此這可能有利于菌株的發(fā)育。

具有外部補料和無創(chuàng)在線監(jiān)測的自動化并行MBR 平臺允許在相對短的時間內(nèi)生成大量高質(zhì)量數(shù)據(jù)集。然而，由于高設(shè)備成本和廣泛的編程要求，投資比更簡單的內(nèi)部系統(tǒng)要大得多。

PART

結(jié)論

04

在過去的十年中，微量高通量分批補料培養(yǎng)技術(shù)取得了長足的進步。已經(jīng)開發(fā)了各種復(fù)雜性和硬件要求不同的補料機制，使得流式分批培養(yǎng)越來越容易獲得。由于與傳統(tǒng)的分批培養(yǎng)系統(tǒng)相比，分批補料系統(tǒng)可以更接近地模擬工業(yè)規(guī)模條件，因此它們可以最大限度地降低與生物工藝規(guī)模相關(guān)的風(fēng)險。盡管成本相對較低且易于實施，在整個培養(yǎng)過程中不可能進行精確的補料速率控制，并且補料通常僅限于單一基質(zhì)。通過引入外部硬件，可以實現(xiàn)更復(fù)雜的補料分布和過程參數(shù)(如 pH)控制。自動液體處理機器人可被編程為響應(yīng)于過程參數(shù)與指定設(shè)定點的偏差或根據(jù)預(yù)定義的補料曲線執(zhí)行液體添加。最近，自動化液體處理機器人的可負擔(dān)性有了顯著提高，然而，為確保其廣泛應(yīng)用，有必要開發(fā)標準化操作程序和直觀的軟件，以便于其簡單操作。盡管它們的高精度和靈活性很有優(yōu)勢，因為補料是通過間歇推注進行的，但無法實現(xiàn)工業(yè)相關(guān)的連續(xù)補料曲線。然而，這可以很容易地通過耦合 LHS 和酶控制的補料策略來解決。微流體技術(shù)也被開發(fā)出來，以便于非常小體積的連續(xù)精確補料。通過將自動化的高通量分批補料培養(yǎng)平臺與實驗的戰(zhàn)略設(shè)計和基于模型的優(yōu)化策略相結(jié)合，可以顯著增強對過程的理解，同時最大限度地減少實驗負擔(dān)。結(jié)合實時數(shù)據(jù)來重新確定最佳補料添加和工藝控制策略顯示出增強生物工藝開發(fā)的巨大潛力。然而，關(guān)鍵工藝參數(shù)的在線和在線分析技術(shù)應(yīng)得到改進，以充分發(fā)揮基于模型的優(yōu)化，在大多數(shù)情況下，對優(yōu)化至關(guān)重要的底物利用率和產(chǎn)物形成等參數(shù)僅限于離線分析。對傳統(tǒng)技術(shù)（如色譜）的快速在線替代品的開發(fā)將特別有利于重新設(shè)計實驗策略。盡管該綜述中討論的技術(shù)顯示出高效和低風(fēng)險生物工藝開發(fā)的巨大潛力，但目前自動化培養(yǎng)平臺的高成本和復(fù)雜性限制了它們的廣泛應(yīng)用。此外，這些技術(shù)和方法的標準化對于學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的共同使用和接受至關(guān)重要，未來的工作還應(yīng)側(cè)重于開發(fā) FOSS 和 FOSH 以提高可訪問性。

曼森平行生物反應(yīng)器分批補料應(yīng)用

曼森采用Watson-malow 400A高精度泵頭，16 路補料，平均每個罐有四路補料，蠕動泵流量可設(shè)定，連續(xù)可調(diào)；每個蠕動泵的功能可單獨分配，可以作為酸泵、堿泵、補料泵、消泡泵、液位控制泵。