SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）

SDS-PAGE 的目的是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小而不是其他物理特征來(lái)分離蛋白質(zhì)。為了理解這是如何工作的，我們必須理解名稱(chēng)的兩半：SDS 和 PAGE。

SDS

由于我們?cè)噲D分離許多不同形狀和大小的不同蛋白質(zhì)分子，我們首先希望它們變性，以便蛋白質(zhì)不再具有任何二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。分子的 3D 結(jié)構(gòu)將決定它在環(huán)境中移動(dòng)的能力。我們使用 SDS 將所有蛋白質(zhì)變性為相同的線(xiàn)性形狀。

圖 1.該圖的頂部顯示了由于蛋白質(zhì)中帶電的 R 基團(tuán)而具有負(fù)電荷和正電荷的蛋白質(zhì)。 大的 H 代表疏水域，非極性 R 基團(tuán)聚集在疏水域中，以試圖擺脫蛋白質(zhì)周?chē)臉O性水。 下圖顯示 SDS 可以破壞疏水區(qū)域并用許多負(fù)電荷包裹蛋白質(zhì)，這些負(fù)電荷壓倒了蛋白質(zhì)由于帶正電荷的 R 基團(tuán)而具有的任何正電荷。 所得蛋白質(zhì)已被 SDS 變性（還原為其一級(jí)結(jié)構(gòu)），因此已被線(xiàn)性化。

SDS（是一種洗滌劑，可以溶解疏水分子，但也帶有負(fù)電荷（硫酸鹽）。 因此，如果用 SDS 孵育細(xì)胞，細(xì)胞膜會(huì)溶解，所有的蛋白質(zhì)都會(huì)被去污劑溶解，而且所有的蛋白質(zhì)都會(huì)被許多負(fù)電荷覆蓋。

PAGE

如果將蛋白質(zhì)變性并置于電場(chǎng)中，它們將以相同的速度向正極移動(dòng)，不會(huì)按大小分開(kāi)。 所以我們需要將蛋白質(zhì)放入一個(gè)允許不同大小的蛋白質(zhì)以不同速率移動(dòng)的環(huán)境中。 選擇的環(huán)境是聚丙烯酰胺，它是丙烯酰胺單體的聚合物。 當(dāng)這種聚合物形成時(shí)，它會(huì)變成凝膠，我們將用電將蛋白質(zhì)拉過(guò)凝膠，因此整個(gè)過(guò)程稱(chēng)為聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)。 聚丙烯酰胺凝膠是由穿過(guò)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的迷宮般的隧道構(gòu)成（圖 2 和圖 3）。

圖 2. 展示了一塊聚丙烯酰胺板（深灰色），其邊緣暴露有隧道（不同大小的紅色環(huán)帶陰影以描繪深度）。凝膠中隨機(jī)散布著許多不同大小的隧道。

圖 3. 這是兩個(gè)選定隧道的俯視圖。 這些隧道一直延伸穿過(guò)凝膠，但它們蜿蜒穿過(guò)凝膠，并不呈直線(xiàn)。 注意兩個(gè)隧道的直徑差異。

現(xiàn)在我們將變性蛋白質(zhì)的混合物施加到凝膠上并施加電流（圖 4）。 如果所有的蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)入凝膠并且有相同的力將它們拉向另一端，那么哪些蛋白質(zhì)能夠更快地穿過(guò)凝膠？顯然，小分子可以比大分子更快地穿過(guò)聚丙烯酰胺。

圖 4. 顯示變性蛋白質(zhì)的混合物開(kāi)始通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠。 遠(yuǎn)端的正極和近端的負(fù)極建立電場(chǎng)。 由于所有的蛋白質(zhì)都帶有很強(qiáng)的負(fù)電荷，它們都會(huì)向箭頭所指的方向移動(dòng)。

當(dāng)我們處理蛋白質(zhì)時(shí)，我們處理的是每種蛋白質(zhì)的許多拷貝。蛋白質(zhì)傾向于成束或帶狀地穿過(guò)凝膠，而且它們的形狀和大小都相同。運(yùn)行 SDS-PAGE 時(shí)，我們不能讓蛋白質(zhì)電泳運(yùn)行太久，以免到達(dá)凝膠的另一側(cè)。我們關(guān)掉電流，然后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，看看它們?cè)谀z中移動(dòng)了多遠(yuǎn)。圖 5 顯示卡通凝膠，圖 6 顯示真實(shí)凝膠。請(qǐng)注意，實(shí)際條帶大小相等，但每個(gè)條帶內(nèi)的蛋白質(zhì)大小不同。

圖 5. 電流開(kāi)啟一段時(shí)間后然后關(guān)閉后 SDS PAGE 的頂視圖。 凝膠有五個(gè)編號(hào)的泳道，其中五個(gè)不同的蛋白質(zhì)樣品（每種蛋白質(zhì)的許多拷貝）被應(yīng)用于凝膠。 （第 1 道，已知大小的分子量標(biāo)準(zhǔn)；第 2 道，三種不同大小的蛋白質(zhì)的混合物，a 是最大的蛋白質(zhì)，c 是最小的蛋白質(zhì)；第 3 道，蛋白質(zhì) a ；第 4 道，蛋白質(zhì) b ； 泳道 5 蛋白質(zhì) c。）請(qǐng)注意，無(wú)論是否與其他蛋白質(zhì)一起（泳道 2）（泳道 3-5），三種蛋白質(zhì)中的每組在凝膠中遷移的距離相同。 分子量標(biāo)準(zhǔn)用于測(cè)量未知蛋白質(zhì)（a、b 和 c）的相對(duì)大小。

圖 6. 這張照片顯示了在凝膠上分離的各種不同蛋白質(zhì)。 此特定圖像顯示了同一蛋白質(zhì)樣品的連續(xù)稀釋?zhuān)员砻餍枰嗌俚鞍踪|(zhì)才能被檢測(cè)到。