大家慢慢也發(fā)現(xiàn)，純生信分析或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，僅挖掘到候選基因是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。找到關(guān)鍵基因后，全面且系統(tǒng)的基因功能驗(yàn)證方案也是高分SCI濃墨重彩的一部分。

今天小薇給大家分類總結(jié)了一下研究關(guān)鍵基因的方法，絕對(duì)的干貨，快收藏起來(lái)！

一、基因表達(dá)定量分析

基因表達(dá)量驗(yàn)證，目的是為了比較候選基因在特定組織/細(xì)胞中與對(duì)照組的表達(dá)差異是否與前期測(cè)序或分析結(jié)果一致。

最常見(jiàn)的方法便是qPCR，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便快捷以及結(jié)果可定量等優(yōu)點(diǎn)。

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二、基因亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位是為了確定目的基因在細(xì)胞內(nèi)的具體位置，包括核內(nèi)、胞質(zhì)內(nèi)或者細(xì)胞膜，從而為理解基因的作用機(jī)制提供研究方向。常見(jiàn)的研究方法包括：

1、免疫熒光標(biāo)記

這是一種將免疫反應(yīng)與化學(xué)光學(xué)信號(hào)結(jié)合起來(lái)的方法，通過(guò)特異性的熒光標(biāo)記抗體與目標(biāo)蛋白/抗原結(jié)合，進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，最后利用熒光顯微鏡觀察熒光所在的細(xì)胞或組織位置，從而確定目標(biāo)蛋白定位。

2、GFP融合蛋白表達(dá)

該方法將綠色熒光蛋白（GFP）作為報(bào)告基因，通過(guò)基因工程技術(shù)將其與目標(biāo)蛋白基因進(jìn)行融合，轉(zhuǎn)染后對(duì)報(bào)告蛋白的引導(dǎo)信號(hào)進(jìn)行跟蹤從而確定目標(biāo)蛋白的定位。

三、基因功能與疾病表型的關(guān)聯(lián)

該研究方法是將目的基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)或敲除，平行開(kāi)展回復(fù)實(shí)驗(yàn)，觀察基因?qū)膊”硇偷挠绊憽?/span>

1、過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

在目的基因上游加入調(diào)控原件，使基因可以在人為控制的條件下實(shí)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的過(guò)表達(dá)，常用于研究mRNA、lncRNA、miRNA等。

2、基因敲低

基因敲低是指通過(guò)降解具有同源序列靶基因的mRNA，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。常見(jiàn)的技術(shù)包括RNA干擾（RNAi）以及CRISPR-Cas9。

其中，RNAi是雙鏈RNA通過(guò)靶向mRNA降解誘導(dǎo)序列特異性基因沉默的生物學(xué)過(guò)程。介導(dǎo)RNAi效應(yīng)的方法包括小干擾RNA（siRNA）、短發(fā)夾RNA（shRNA），已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄后敲除單個(gè)基因的表達(dá)。

CRISPR-Cas9是一種來(lái)源于微生物免疫系統(tǒng)的可編程核酸酶。其核酸酶Cas9可由與目標(biāo)DNA鏈互補(bǔ)的單一引導(dǎo)RNA（sgRNA）指導(dǎo)，sgRNA通過(guò)互補(bǔ)與目標(biāo)鏈結(jié)合，從而引導(dǎo)Cas9在目標(biāo)DNA序列上產(chǎn)生位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂，從而達(dá)到對(duì)目的基因進(jìn)行修飾的目的。與RNAi相比，CRISPR產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)更少，并且可以針對(duì)整個(gè)基因組的編碼和非編碼區(qū)域。

3、疾病表型研究

在過(guò)表達(dá)/敲低目的基因的基礎(chǔ)上，開(kāi)展體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)觀察疾病表型變化（包括增殖、凋亡、周期、侵襲、遷移、自噬、血管生成等）。同時(shí)可以平行開(kāi)展回復(fù)實(shí)驗(yàn)（比如添加特異性抑制劑或激活劑進(jìn)行挽救，或?qū)φ{(diào)控下游進(jìn)行反向干預(yù)），觀察疾病表型的變化是否被逆轉(zhuǎn)。

四、基因上下游調(diào)控機(jī)制研究

目的是探究RNA與RNA或RNA與蛋白質(zhì)之間的上下游調(diào)控關(guān)系，常見(jiàn)的互作研究方法包括：

1、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

該方法利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特點(diǎn)，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件克隆在螢火蟲(chóng)熒光素酶基因上游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。同時(shí)，將帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒作為對(duì)照質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性來(lái)識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)域的相互作用。

2、RNA pull-down

該方法利用生物素標(biāo)記的RNA探針，通過(guò)與含有目的蛋白的溶液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可以特異性結(jié)合磁珠，從而與其他蛋白分離。洗脫后，通過(guò)蛋白凝膠電泳或WB實(shí)驗(yàn)，對(duì)下拉的蛋白進(jìn)行分析。

3、免疫沉淀（IP）

這是一種利用抗原抗體特異性反應(yīng)純化富集樣品中目的蛋白的一種方法，收集到免疫復(fù)合物沉淀后，根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)的不同將其分為CHIP、RIP和CO-lP。

其中，CHIP可捕獲與已知蛋白相結(jié)合的DNA，隨后通過(guò)qPCR、基因芯片或者測(cè)序等技術(shù)對(duì)DNA產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒定。

RIP主要用于分離與目標(biāo)蛋白可能結(jié)合的RNA，純化后再利用RT-qPCR或測(cè)序來(lái)探究其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制。與ChIP實(shí)驗(yàn)不同的是，RIP復(fù)合物不需要固定，且反應(yīng)體系中不能包含RNA酶等等。

CO-lP可以用IP級(jí)別抗體去下拉所有可能與已知蛋白結(jié)合的蛋白，隨后利用WB或者MS對(duì)產(chǎn)物蛋白進(jìn)行分析和鑒定。

以上便是小薇總結(jié)的對(duì)候選基因開(kāi)展功能研究的常見(jiàn)方法，小伙伴們可根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和周期的實(shí)際情況，挑選合適的研究方法進(jìn)行組合，來(lái)給自己的生信分析或轉(zhuǎn)錄組學(xué)文章錦上添花~

當(dāng)然了，如果對(duì)這些方法還不熟悉，或者不知道如何來(lái)進(jìn)行挑選和組合以達(dá)到理想的目標(biāo)分值，都可以掃碼聯(lián)系小薇，讓我們來(lái)給你出謀劃策哦！