Cell Counting Kit-8，簡(jiǎn)稱(chēng)CCK-8試劑盒或CCK8試劑盒，是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測(cè)的試劑盒，可用于細(xì)胞因子等誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測(cè)，也可以用于抗癌藥物等對(duì)細(xì)胞有毒試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)，或一些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)。

檢測(cè)原理：該試劑中含有WST-8（水溶性四唑鹽），在電子載體1-Methoxy PMS（電子傳遞介質(zhì)）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)常見(jiàn)問(wèn)題及注意事項(xiàng)

問(wèn)?為什么測(cè)出的吸光度數(shù)值較低？

答
1. 細(xì)胞數(shù)量過(guò)低——可以適當(dāng)增加待測(cè)細(xì)胞數(shù)量；
2. 染色難度大——建議增加CCK-8孵育時(shí)間。

?

問(wèn)?為什么數(shù)據(jù)重復(fù)性差？

答
1. 孔板最外圈試劑容易揮發(fā)，建議最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測(cè)定孔用。
2. CCK-8沾壁，建議加入CCK-8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。
3. 細(xì)胞數(shù)量過(guò)多或過(guò)少，建議預(yù)先在1000-100000個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。
4. 孔內(nèi)氣泡干擾酶標(biāo)儀檢測(cè)，檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)無(wú)氣泡。

?

問(wèn)?在做細(xì)胞的加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，藥物對(duì)CCK-8測(cè)定是否有影響？

答

1. 注意如果藥物具有還原性(如維生素C)，會(huì)和CCK-8發(fā)生顯色反應(yīng)，增加吸光度。

2. 藥物中的金屬對(duì)CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛、氧化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10mM的話(huà)，將會(huì)100%抑制。
? ??解決辦法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測(cè)定450nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基(加CCK-8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

3. 由于培養(yǎng)基中可能含有氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)，在正式實(shí)驗(yàn)之前，建議使用一個(gè)孔作一下檢測(cè)，有必要先確認(rèn)培養(yǎng)基和CCK-8是否反應(yīng)，一般正常的OD值應(yīng)該在0.4以下。

問(wèn)?可否采用CCK-8法進(jìn)行藥物的IC50檢測(cè)？

答?可以，將細(xì)胞培養(yǎng)后按照不同濃度的藥物處理一定時(shí)間后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，根據(jù)吸光度繪制曲線，計(jì)算該藥物抑制細(xì)胞數(shù)量一半時(shí)的濃度(IC50)。

?

問(wèn)?CCK-8對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？

答?不一樣，懸浮細(xì)胞較貼壁細(xì)胞難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對(duì)于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過(guò)延長(zhǎng)CCK-8的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來(lái)解決。

?

問(wèn)?若是暫不檢測(cè)OD值，該如何處理？

答?若暫時(shí)不測(cè)定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL 0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

?

問(wèn)?用CCK-8測(cè)細(xì)胞活力時(shí)每次都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？

答?建議每次做，雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣。對(duì)于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

文章來(lái)源：“百奧創(chuàng)新”公眾號(hào)，作者~
免責(zé)聲明：本公眾號(hào)所載文章版權(quán)歸原作者所有。轉(zhuǎn)載文章旨在知識(shí)分享，如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)和其它問(wèn)題，請(qǐng)聯(lián)系我們刪除！