多基因通路復(fù)雜且動(dòng)態(tài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控驅(qū)動(dòng)著許多重要的細(xì)胞活動(dòng)，包括基因組復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞分裂和分化以及疾病進(jìn)展和遺傳。了解基因網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜功能需要通過(guò)抑制或激活來(lái)精確操縱或擾亂靶標(biāo)基因的表達(dá)。眾所周知，CRISPR/Cas9技術(shù)是基因編輯常用的手段，前面小編對(duì)其應(yīng)用細(xì)節(jié)做了具體介紹，本期小編為大家?guī)?lái)了自CRISPR/Cas9系統(tǒng)衍生而來(lái)的、用于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的CRISPR/dCas9系統(tǒng)相關(guān)知識(shí)。

常規(guī)Cas9蛋白有6個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是Rec I、Rec II、Bridge Helix、PAM Interacting、HNH和RuvC。Rec I是6個(gè)中最大的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)結(jié)合sgRNA。一旦結(jié)合了靶DNA，Bridge Helix就負(fù)責(zé)啟動(dòng)剪切。而PAM interacting結(jié)構(gòu)域則賦予Cas9識(shí)別DNA上的特異性PAM序列的能力，負(fù)責(zé)啟動(dòng)與靶DNA的結(jié)合。HNH和RuvC都是核酸酶結(jié)構(gòu)域，分別剪切一條DNA鏈。通過(guò)將RuvC（D10A）和NHN（H840A）兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行氨基酸突，從而得到一個(gè)沒(méi)有核酸酶活性的Cas9蛋白，使其失去切割DNA的功能，但仍保留結(jié)合DNA的能力，這樣的Cas9 稱(chēng)之為dCas9（Dead Cas9）。目前CRISPR/dCas9系統(tǒng)常用于基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控，用以激活或抑制特定基因的表達(dá)，從而達(dá)到研究基因功能的目的。

圖1. Cas9及dCas9工作原理圖（圖片來(lái)源：Dominguez AA et?al，2016）

轉(zhuǎn)錄抑制（CRISPRi）：通過(guò)將?dCas9 與序列特異性 sgRNA 配對(duì)，dCas9-sgRNA 復(fù)合物可以結(jié)合至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近，通過(guò)物理性阻斷 RNA 聚合酶 (Pol) 與靶標(biāo)DNA結(jié)合來(lái)干擾靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄延伸，還可以通過(guò)破壞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合來(lái)阻礙轉(zhuǎn)錄起始，達(dá)到基因沉默或減少基因轉(zhuǎn)錄的效果。為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄抑制的效率，dCas9可融合某些基因抑制結(jié)構(gòu)域，如KRAB結(jié)構(gòu)域（轉(zhuǎn)錄抑制子的保守結(jié)構(gòu)域，可與 DNA 結(jié)合蛋白融合以實(shí)現(xiàn)靶向轉(zhuǎn)錄抑制）。此外，dCas9也可以融合雙抑制結(jié)構(gòu)域（bipartite repressor domain）KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。一個(gè)完整的?CRISPRi系統(tǒng)包含兩個(gè)部分，sgRNA表達(dá)載體和dCas9-KRAB（或者dCas9-KRAB-MeCP2）表達(dá)載體。設(shè)計(jì)基因抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)，只需要設(shè)計(jì)靶標(biāo)基因的sgRNA表達(dá)載體即可。另外還可將dCas9與四個(gè)串聯(lián)的mSin3相互作用結(jié)構(gòu)域（存在于多個(gè)轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白上的相互作用域，SID4X）或Max相互作用蛋白1（Mxi1）融合表達(dá)，同樣也被證明具備抑制靶標(biāo)基因表達(dá)的效果。

圖2.CRISPRi工作原理圖（圖片來(lái)源：Dominguez AA et?al，2016）

CRISPRi系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)：不改變內(nèi)源基因組背景，與CRISPR基因編輯、傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)不同，該系統(tǒng)不會(huì)改變靶基因位點(diǎn)基因組序列；強(qiáng)基因抑制效果，使用該系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制通?？梢垣@得高水平的基因抑制效果；更多適用的基因種類(lèi)，由于dCas9-KRAB CRISPRi系統(tǒng)是在DNA水平抑制基因表達(dá)，因此適用于多種轉(zhuǎn)錄本，包括mRNA、非編碼RNA、microRNA、反義轉(zhuǎn)錄本、核定位RNA以及聚合酶III 轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄抑制；特異性，dCas9-KRAB CRISPRi系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)高效抑制同時(shí)，幾乎沒(méi)有脫靶現(xiàn)象；可以針對(duì)不同基因設(shè)計(jì)多個(gè)sgRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因的同時(shí)抑制。但由于dCas9-KRAB需要接觸到靶標(biāo)基因的調(diào)控序列，因此會(huì)因?yàn)椴煌蛩幦旧w位置不同而產(chǎn)生不同的抑制程度，這取決于它們的內(nèi)源染色質(zhì)狀態(tài)，另外dCas9 可能會(huì)抑制操縱子內(nèi)的下游基因（極性效應(yīng)）而不是單個(gè)基因。

轉(zhuǎn)錄激活（CRISPRa）：通過(guò)使用dCas9融合蛋白來(lái)招募轉(zhuǎn)錄激活因子，從而達(dá)到靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄激活或上調(diào)的效果。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，VP64（一種轉(zhuǎn)錄激活子，由四個(gè)串聯(lián)拷貝的單純皰疹病毒VP16激活結(jié)構(gòu)域組成，通過(guò)Gly-Ser連接子連接。）、p65激活結(jié)構(gòu)域 (NF-κB轉(zhuǎn)錄因子核形式多肽的主要反式激活結(jié)構(gòu)，p65AD) 或Rta47（人類(lèi)皰疹病毒R反式激活子）與 dCas9 的融合可以通過(guò)單個(gè) sgRNA激活靶標(biāo)基因。通過(guò)同時(shí)在dCas9的氨基和羧基末端的融合VP64、串聯(lián)多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄激活因子或添加了多個(gè) VP16 拷貝可以表現(xiàn)出更強(qiáng)的激活能力。

另外，sgRNA工程改造也被證明可以提高基因激活的效率。通過(guò)將蛋白質(zhì)相互作用RNA適體MS2添加到 sgRNA 中，實(shí)現(xiàn)了一種稱(chēng)為協(xié)同激活介體 (SAM) 系統(tǒng)的改進(jìn)：?MS2可招募p65AD與熱休克因子1(HSF1)融合蛋白。與單獨(dú)的 dCas9-VP64 相比，SAM 技術(shù)與 dCas9-VP64 結(jié)合使用，進(jìn)一步增強(qiáng)了內(nèi)源基因的激活效率。具體操作過(guò)程：向?qū)嶒?yàn)細(xì)胞共轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種分別攜帶dCas9:VP64和MS2:P65:HSF1的表達(dá)載體，進(jìn)行抗性篩選。然后使用遞送sgRNA/MS2的第三種表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并用另一種抗生素進(jìn)行篩選，即可達(dá)到激活或增強(qiáng)靶標(biāo)基因表達(dá)的目的。

圖3.?CRISPRa工作原理圖（圖片來(lái)源：Dominguez AA et?al，2016）

CRISPRa的優(yōu)勢(shì)：與CRISPRi一致，CRISPRa可以激活內(nèi)源基因組的轉(zhuǎn)錄，但不會(huì)改變靶基因位點(diǎn)基因組序列；無(wú)需預(yù)先了解靶標(biāo)基因的天然調(diào)控機(jī)理，僅需知曉靶位點(diǎn)DNA序列的準(zhǔn)確信息；使用SAM系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活的基因通?？梢缘玫捷^高水平的表達(dá)，但該系統(tǒng)需要三個(gè)載體共同作用，轉(zhuǎn)染/感染難度相對(duì)較大。且目前尚未有sgRNA/MS2RNA靶向特異性的評(píng)估的有效方法。

提高轉(zhuǎn)錄抑制或激活的sgRNA優(yōu)化細(xì)節(jié)：對(duì)于CRISPRi，靶向特定基因TSS的-50至+300bp區(qū)間可實(shí)現(xiàn)強(qiáng)抑制，在TSS下游+50bp至+100bp處可實(shí)現(xiàn)最大抑制效果；sgRNA中避免出現(xiàn)連續(xù)相同堿基序列（例如TTTT或CCCC）。對(duì)于使用多激活因子串聯(lián)的CRISPRa，當(dāng)靶向TSS上游-50bp至-400bp的區(qū)間時(shí)，發(fā)現(xiàn)了最佳的基因激活；對(duì)于使用SAM系統(tǒng)的激活，最佳靶向區(qū)間為T(mén)SS的-200bp至+1bp，另外當(dāng)靶向啟動(dòng)子區(qū)域和區(qū)域中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合點(diǎn)時(shí)sgRNA與DNA正義鏈或反義鏈結(jié)合都具有良好的抑制效果，但靶向啟動(dòng)子區(qū)域的下游時(shí)只有與非模板鏈結(jié)合才有效。CRISPRi的效率很大程度上依賴(lài)于招募的效應(yīng)復(fù)合物與靶基因TSS的結(jié)合位置。

CRISPRi和CRISPRa均可通過(guò)針對(duì)不同的基因設(shè)計(jì)不同的sgRNA進(jìn)行批量調(diào)控或?qū)崿F(xiàn)同時(shí)激活/抑制某些功能相關(guān)的基因，是了解復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)功能的利器。漢恒專(zhuān)營(yíng)工具病毒十余載，可提供CRISPRi/CRISPRa的相關(guān)質(zhì)粒以及病毒工具，如有技術(shù)問(wèn)題或產(chǎn)品訂購(gòu)需求，歡迎隨時(shí)咨詢(xún)！

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