Weston Blot

1.實(shí)驗(yàn)原理

• 1、檢測(cè)已知蛋白：
• 一抗和目的蛋白直接特異性結(jié)合
• 2、檢測(cè)未知蛋白：
• 先用標(biāo)簽蛋白His-tag連接未知蛋白
• 二抗帶有辣根過(guò)氧化物酶，二抗和一抗特異性結(jié)合

2.總流程

1.樣品制備 分三步

• 需要全程冰上操作

1.1.樣品處理：

1.2.裂解:有時(shí)會(huì)需要檢測(cè)磷酸化蛋白或去乙?；鞍?，則相應(yīng)酶對(duì)其影響較大

1.3.蛋白定量

• 意義/目的：不同處理組樣品得到的目的蛋白 的電泳上樣量需要保持一致
• 細(xì)胞蛋白目的蛋白含量較高，組織樣品目的蛋白含量較少，實(shí)際操作通過(guò)“預(yù)實(shí)驗(yàn)”進(jìn)行調(diào)整

• 定量方法：
• BCA法：如果樣品自帶螯合劑等干擾產(chǎn)品，則考慮另外的定量方法
• 考馬斯亮藍(lán)法：普通型對(duì)去垢劑（裂解液）不耐受

2.SDS-PAGE電泳

2.1.原理

• SDS斷裂氫鍵、 破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、且與蛋白質(zhì)成比例結(jié)合——帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物（SDS自身帶負(fù)電）
• 所以電泳時(shí)，遷移速度僅取決于分子大小
• 目的蛋白大小與分離膠濃度

2.2.制膠

• 充分凝固（20min+）
• 倒時(shí)避免氣泡

2.3.樣品制備

• 分段電泳

3.轉(zhuǎn)膜

• 膜
• 切角區(qū)分正反方向
• 蛋白膠必須放負(fù)極，向正極跑
• 手不能接觸濾紙（濾紙易與蛋白結(jié)合）
• 每一層之間都要防止氣泡
• 充分浸潤(rùn)轉(zhuǎn)膜液
• 
  

• 確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)marker
• 麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜效果；但蛋白濃度低時(shí)即使染色看不見，曝光仍然可以顯影出二抗

4.封閉 注意封閉液

• 封閉時(shí)間

5.抗體雜交/孵育--一抗 二抗

常見老鼠、兔子選擇單抗效果好

不常見的如菌、組織可以使用多抗

• 洗滌液 一般洗三到五次
• 3次 10min≠1次 30min

• 二抗

6.顯色發(fā)光

• ECL顯色液注意現(xiàn)配現(xiàn)用

總結(jié)-注意事項(xiàng)

試劑總結(jié)

導(dǎo)致“背景高”的問題＆解決

無(wú)條帶/信號(hào)弱

其他問題

• BCA蛋白定量--雙標(biāo)準(zhǔn)曲線
• 分離膠和濃縮膠一般半小時(shí)，冬天可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間
• 封閉時(shí)需在搖床上
• weston和elasa相輔相成。weston半粗定量，elasa定量定性
• 倒?jié)饪s膠有氣泡，可以倒的時(shí)候慢一點(diǎn)，用針將氣泡戳掉。