納米抗體（nanobody, Nb），即重鏈抗體VHH（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody）——駱駝體內(nèi)存在著天然缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy-chain antibody, HCAb)，克隆其可變區(qū)而得到的只由一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的抗體，是目前可以得到的具有完整功能的穩(wěn)定的可結(jié)合抗原的最小單位。 納米抗體和人抗體重鏈可變區(qū)VH結(jié)構(gòu)非常相似，包含三個(gè)高變區(qū)(hypervariable region, HVR)和其兩側(cè)的四個(gè)骨架區(qū)(framework region, FR)，且其基因同源性達(dá)80%~90%。VHH由兩個(gè)B片層形成支架，三個(gè)高變區(qū)聚集在一側(cè)參與抗原識(shí)別。納米抗體的抗原結(jié)合環(huán)的結(jié)構(gòu)組成比普通抗體VH更大，其CDR1和CDR3比VH的更長(zhǎng)——人和小鼠VH的平均長(zhǎng)度分別只有14和12個(gè)氨基酸，而納米抗體的CDR3長(zhǎng)度為16~18個(gè)氨基酸。 納米抗體的常用的制備方法是通過(guò)免疫學(xué)和基因工程等技術(shù)，從駱駝科動(dòng)物體內(nèi)分離出重鏈抗體，提取總 RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得模板。根據(jù)重鏈抗體保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR法擴(kuò)增獲得全套重鏈抗體可變區(qū)基因，而后將其克隆至載體，體外表達(dá)獲得含有多種單價(jià)Nb的抗體庫(kù)。應(yīng)用特異性抗原從Nb庫(kù)中經(jīng)過(guò)多次淘選即可得到抗原特異的 Nb。Nb的制備與篩選常用的為噬菌體天然抗體庫(kù)和抗原傾向性抗體庫(kù)兩類。Nb的親和力、特異性等分子特征的優(yōu)劣取決于噬菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容和多樣性兩大因素。天然抗體庫(kù)是從未經(jīng)免疫的駱駝科動(dòng)物B淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增得到抗體的 V區(qū)基因，隨后重組到噬菌體中形成的抗體庫(kù)。如此得到的抗體特異性相對(duì)較低，而且只有庫(kù)容足夠大10

-10

時(shí)才可能篩選到高親和力的抗體?？乖瓋A向性抗體庫(kù)的庫(kù)容量比天然庫(kù)低，但抗體庫(kù)中能夠識(shí)別特定抗原的特異性功能抗體較高，易于篩選到高親和力的目的抗體。 除了常規(guī)的抗體庫(kù)篩選的方法外，也可以使用單個(gè)B細(xì)胞抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)進(jìn)行納米抗體的制備。單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)是一種體外克隆和表達(dá)單個(gè)抗原特異性 B 細(xì)胞抗體基因技術(shù)，這種方法保留了輕重鏈可變區(qū)的天然配對(duì)，具有基因多樣性好、效率高、全人源需要的細(xì)胞量少等優(yōu)勢(shì)。它的主要流程為從免疫動(dòng)物獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行抗原特異性結(jié)合B細(xì)胞的分選，接著通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)得到單個(gè)B細(xì)胞抗體可變區(qū)基因，再通過(guò)載體構(gòu)建獲得抗體表達(dá)，最后進(jìn)行產(chǎn)物驗(yàn)證。

德泰生物提供羊駝納米抗體發(fā)現(xiàn)服務(wù)，使用自主研發(fā)羊駝VHH SingleB

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快速發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，通過(guò)流式和DeepLight

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平臺(tái)進(jìn)行記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞雙篩選，實(shí)現(xiàn)全流程90天交付，并承諾交付大量陽(yáng)性克隆的同時(shí)保證抗體多樣性。

案例分享

擁有自建羊駝養(yǎng)殖基地，保證項(xiàng)目使用未經(jīng)免疫羊駝；自研動(dòng)物免疫方案，可根據(jù)抗原類型定制優(yōu)化免疫方案，提供包括蛋白、多肽、細(xì)胞免疫等。

利用B細(xì)胞表面標(biāo)志物，使用流式細(xì)胞儀對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選，最終獲得抗原特異性MBC，并分選至96孔板中。

分選出的抗原特異性MBC，經(jīng)過(guò)RT-PCR、及基因特異性PCR，最終獲取重鏈序列。利用德泰BGE

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高通量表達(dá)并進(jìn)行ELISA和FACS功能驗(yàn)證。在篩選后擴(kuò)增的96個(gè)B細(xì)胞中，ELISA結(jié)合60株，F(xiàn)ACS結(jié)合57株。57個(gè)FACS結(jié)合抗體中，序列多樣性可達(dá)70%以上。