細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是由膠原蛋白、蛋白多糖、彈性蛋白等組成的三維非細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，幾乎存在于所有的組織中。細(xì)胞的形狀、增殖分化、遷移侵襲及信息傳遞等過(guò)程都與ECM密切相關(guān)，異常的ECM蛋白引發(fā)纖維生成和腫瘤病變。由于對(duì)ECM中不溶性基質(zhì)蛋白的提取仍然是一個(gè)瓶頸，目前對(duì)組織中ECM的病理生理組成和變化的了解是有限的。

徹底去除ECM中的細(xì)胞成分是表征ECM不溶性基質(zhì)蛋白圖譜的關(guān)鍵。近日，青蓮百奧合作客戶(hù)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》上發(fā)表了一篇題為“Pipeline for precise insoluble matrisome coverage in tissue extracellular matrices”的研究文章。在這項(xiàng)研究中，提出了使用增強(qiáng)的十二烷基磺酸鈉(E-SDS)用于徹底的組織脫細(xì)胞及一套完整的流程，用于準(zhǔn)確鑒定和定量高度不溶性ECM基質(zhì)蛋白以了解ECM的蛋白質(zhì)組特征。

標(biāo)題：Pipeline for precise insoluble matrisome coverage in tissue extracellular matrices

期刊：Frontiers in Bioengineering and Biotechnology

IF：6.064

時(shí)間：2023.05

研究背景

ECM中大多數(shù)核心基質(zhì)蛋白具有較大的分子量并且是共價(jià)交聯(lián)，因此它們也大多不溶且難以提取。目前物理、化學(xué)、酶處理及十二烷基磺酸鈉(SDS)脫細(xì)胞的方法對(duì)ECM不溶性基質(zhì)蛋白無(wú)法實(shí)現(xiàn)良好的提取，難以實(shí)現(xiàn)精確的基質(zhì)蛋白質(zhì)組覆蓋。

研究思路

本研究通過(guò)改進(jìn)的E-SDS脫細(xì)胞方法對(duì)小鼠的9種器官進(jìn)行處理，評(píng)估該方法脫細(xì)胞的效率、SDS的殘留量及膠原的完整性。通過(guò)Labelfree定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)不同器官脫細(xì)胞基質(zhì)（dECM）中不溶性基質(zhì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量及差異比較（青蓮百奧提供技術(shù)服務(wù)）。通過(guò)和Baiocchini的SDS方法對(duì)比，評(píng)估E-SDS脫細(xì)胞方法的性能。

研究?jī)?nèi)容

1.E-SDS方法脫細(xì)胞效率高，dECM純度高

所有經(jīng)過(guò)E-SDS脫細(xì)胞的小鼠器官在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)(6 - 48小時(shí))變成白色(脂肪、肝臟、肺和胃)、灰白色(心臟、腎臟和脾臟)或透明(腦和十二指腸)。除腦外，dECM支架在結(jié)構(gòu)上保持了天然器官的形態(tài)學(xué)和先天顯微結(jié)構(gòu)。與天然器官相比，所有脫細(xì)胞的器官都失去了常駐細(xì)胞特有的綠色，剩余的dECM支架呈現(xiàn)粉紅色，表明脫細(xì)胞成功，ECM大量富集，細(xì)胞碎片很少保留。此外，彈性蛋白染色也證實(shí)了脫細(xì)胞后彈性纖維的富集。E-SDS具有用于小鼠組織或器官脫細(xì)胞的潛力，在dECM支架純化具有相對(duì)較高的效率。

2.采用E-SDS脫細(xì)胞技術(shù)制備的dECM支架中SDS殘留量更低，膠原纖維完整性更高

通過(guò)測(cè)定天然組織和dECM支架中的核物質(zhì)。在第一輪脫細(xì)胞液中所有組織的DNA含量都很高，而在第二輪脫細(xì)胞液中DNA含量急劇下降，說(shuō)明脫細(xì)胞主要發(fā)生在第一輪脫細(xì)胞。檢測(cè)dECM支架中SDS的殘留量，丙酮沉淀前的dECM支架中SDS殘留量較高，而丙酮洗滌后的dECM支架中SDS含量幾乎檢測(cè)不到，說(shuō)明丙酮具有很強(qiáng)的SDS沉淀能力。通過(guò)對(duì)膠原蛋白特異性免疫染色的3D重建和掃描電鏡分析顯示，來(lái)自對(duì)照組、纖維化組和纖維化消退組小鼠肝臟的dECM支架中膠原纖維的排列和取向得到了很好的保存。

3.小鼠組織的dECM支架中的高度不溶性基質(zhì)蛋白組分析

采用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示小鼠組織中dECM支架中高度不溶性的基質(zhì)蛋白。9種dECM支架的基質(zhì)數(shù)與總蛋白數(shù)之比為32.8% ~ 50.3%?；|(zhì)蛋白豐度與總蛋白豐度之比從78.5%到96.2%，表明E-SDS方法可以保留更多的細(xì)胞外不溶性蛋白，具有用于廣泛組織中不溶性基質(zhì)蛋白的質(zhì)譜分析的潛力。與之前的報(bào)道相比，蛋白多糖在所有小鼠組織中的數(shù)量最多，但在所有dECM支架中，膠原蛋白是最豐富的不溶性基質(zhì)蛋白。

4.不同小鼠組織中不溶性基質(zhì)蛋白的比較

接下來(lái)比較了小鼠組織9種器官中不溶性基質(zhì)蛋白組成的差異。大多數(shù)基質(zhì)蛋白在所有組織中均表達(dá)，而少數(shù)蛋白表現(xiàn)出組織特異性。例如，只有腎dECM支架中表達(dá)TINAG和MEP1A蛋白；LAMC2、AGRN?和LAMA3蛋白僅在肺dECM支架中發(fā)現(xiàn)；TINAGL1和ANXA7蛋白僅在腦dECM支架中發(fā)現(xiàn)。除組織特異性外，共有8種膠原蛋白、6種ECM糖蛋白和1種蛋白聚糖在所有組織中以不同的豐度的表達(dá)。這些常見(jiàn)的基質(zhì)蛋白彼此之間高度相互作用，可能構(gòu)成了小鼠組織中核心的不溶性基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。KEGG功能注釋分析顯示，這些基質(zhì)蛋白與纖維形成、免疫和增殖等相關(guān)，涵蓋了dECM支架的生物學(xué)功能。

5.E-SDS方法對(duì)不溶性基質(zhì)精確覆蓋的性能評(píng)價(jià)

為了評(píng)估E-SDS方法在組織細(xì)胞外基質(zhì)中精確覆蓋不溶性基質(zhì)的性能，比較了使用E-SDS和Baiocchini的SDS方法的dECM支架。使用E-SDS和Baiocchini的SDS方法獲得的肝dECM支架中各類(lèi)別基質(zhì)成分的數(shù)量或豐度存在較大差異；相比之下，E-SDS法處理的肝dECM支架中膠原蛋白和糖蛋白的數(shù)量和豐度都占最多。因此E-SDS方法可能能夠消除更多的ECM相關(guān)蛋白、ECM調(diào)節(jié)因子和ECM支架中的分泌因子。進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光染色以驗(yàn)證LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)幾乎檢測(cè)不到GAPDH，表明使用兩種SDS方法在肝dECM支架中幾乎沒(méi)有保留細(xì)胞碎片；由Baiocchini的SDS法處理在肝dECM支架中鑒定出分泌的LOXL1（ECM調(diào)節(jié)因子）和MAGP1（ECM糖蛋白），而E-SDS方法則沒(méi)有；兩種SDS方法均可在肝dECM支架中高度富集ECM結(jié)構(gòu)蛋白，如III型膠原、VI型膠原和彈性蛋白?？偟膩?lái)說(shuō)，E-SDS方法結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析可以鑒定和定量組織細(xì)胞外基質(zhì)中高度不溶性的基質(zhì)蛋白。

總結(jié)

該研究提出了一個(gè)E-SDS脫細(xì)胞的流程，該方法對(duì)不溶性基質(zhì)蛋白的提取純度和保留率更高，適用于全局不溶性基質(zhì)蛋白的表征。相比Baiocchini的SDS方法，該方法成本低，操作簡(jiǎn)單，更適用于不溶性基質(zhì)蛋白。該研究將為組織不溶性基質(zhì)分析提供一個(gè)低成本、簡(jiǎn)單、可靠和有效的方法，有助于了解ECM的發(fā)現(xiàn)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究。