神經(jīng)退行性疾病 蛋白聚集體研究

挑戰(zhàn)及解決方案

9月21日是世界阿爾茨海默病日。至今全球約有5500萬(wàn)患者，平均每3秒就有1人患病。預(yù)計(jì)到2050年，這一數(shù)字將增加至1.39億。阿爾茨海默病自1910年被命名后的一個(gè)多世紀(jì)，全球藥企投入了超過(guò)6千億美金進(jìn)行藥物研發(fā)。不幸的是，目前用于臨床的針對(duì)性藥物只有6款，而且只能延緩病情（來(lái)源：2021 Alzheimer's Disease Facts and Figures），其中最新上市的Aducanumab更引起了巨大的爭(zhēng)議。

阿爾茨海默病成因較為復(fù)雜，目前尚無(wú)特別明確的機(jī)制。通過(guò)對(duì)大量病例及臨床結(jié)果的分析研究，有多種不同的理論假說(shuō)，其中廣為接受并進(jìn)行藥物開發(fā)的有：遺傳性機(jī)制、膽堿能假說(shuō)、β-淀粉樣蛋白假說(shuō)、Tau蛋白假說(shuō)等。例如Aducanumab是基于β-淀粉樣蛋白假說(shuō)而開發(fā)研制的一種單克隆抗體藥物。不光是阿爾茨海默病，幾乎所有神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志，或者說(shuō)關(guān)鍵過(guò)程都是蛋白聚集。比如帕金森病中α-突觸核蛋白，亨廷頓氏舞蹈病中突變亨廷頓蛋白聚集形成具有細(xì)胞毒性的斑塊或纏結(jié)，引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞的退化甚至死亡從而影響大腦功能。

因此，針對(duì)這些蛋白聚集體進(jìn)行病理機(jī)制研究尋找生物標(biāo)志物以及新的靶點(diǎn)，從而開發(fā)診斷示蹤劑或治療藥物顯得尤為迫切，而尋找能夠特異性結(jié)合蛋白聚集體的配體分子更是重中之重。

? ?Why MST ?? ?

然而蛋白聚集體與配體（尤其是小分子）的相互作用檢測(cè)卻十分棘手。比如聚集體致病途徑中，毒性最強(qiáng)的寡聚蛋白通常只在低濃度下形成，并且維持時(shí)間很短。此外，分子量較小的配體（如小分子化合物）結(jié)合到蛋白聚集體上所引起的信號(hào)變化很微弱。如果僅通過(guò)分子量變化檢測(cè)，極易受到背景信號(hào)的干擾而產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。

目前用于蛋白配體結(jié)合檢測(cè)的常用方法有以下幾種：ITC、THT、SPR。相比之下，MST 在研究蛋白聚集體時(shí)有著明顯優(yōu)勢(shì)：

1?檢測(cè)速度快，一對(duì)樣品僅需10分鐘

2?樣品消耗量低，毛細(xì)管上樣僅需10μl

3?靈敏度高，不僅僅依賴于單一指標(biāo)，結(jié)合引起的分子量、電荷及水化層的變化都能檢測(cè)到

在本系列中，我們將陸續(xù)和大家分享 MST 技術(shù)在神經(jīng)退行性疾病機(jī)制研究、診斷示蹤劑和抑制劑開發(fā)中的應(yīng)用。今天介紹鋅離子促進(jìn) Tau 蛋白纖維化的檢測(cè)案例。

應(yīng)用案例

MST 在蛋白聚集體與離子互作檢測(cè)中發(fā)揮的作用

Tau 蛋白是一種微管結(jié)合蛋白（MAP），此前的研究認(rèn)為過(guò)度磷酸化的 Tau 會(huì)形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，也有研究指出鋅離子的結(jié)合會(huì)加速 Tau 蛋白的纖維化進(jìn)程（圖1）。因此，表征鋅離子與 Tau 之間的相互作用，有助于我們進(jìn)一步理解疾病發(fā)生的分子機(jī)制。但由于 Tau 蛋白可能會(huì)發(fā)生聚集，并且鋅離子的分子量非常低，檢測(cè)它們之間的相互作用非常困難。

使用 MST 技術(shù)成功檢測(cè)到了 Tau 蛋白與鋅離子之間的相互作用。圖 3 為典型的 MST 結(jié)合曲線，呈現(xiàn)為“S”形。圖 4 為 Tau 蛋白與鋅離子的結(jié)合曲線，可以明顯看到紅框中高濃度的鋅離子并未達(dá)到飽和，而是出現(xiàn)了另一段信號(hào)變化。在加入 5mM 的 EDTA 螯合鋅離子后所有的變化均消失。這表明 Tau 蛋白與鋅離子有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)且親和力不同。

MST 技術(shù)不僅可以定量檢測(cè)親和力，還可通過(guò)原始曲線反饋溶液中樣品是否存在聚集。如果 MST 曲線為圖 5 所示的平滑曲線，則表明樣品無(wú)聚集。如果 MST 曲線出現(xiàn)圖 6 中的 “跳動(dòng)”，則表明樣品存在聚集，Monolith 的智能化軟件會(huì)出現(xiàn)自動(dòng)提示。

加入鋅離子后立即上機(jī)檢測(cè)（0min），此時(shí)的 MST 曲線平滑，表明溶液中無(wú)聚集體存在。而在孵育 20 或 40 分鐘后，可以看到鋅離子濃度大于 50 μM 時(shí)的 MST 曲線波動(dòng)很大，表明 Tau 蛋白與鋅離子孵育一段時(shí)間后發(fā)生了聚集，結(jié)果與文獻(xiàn)一致?(Li et al., 2019)。

從應(yīng)用案例中可以看出，MST 技術(shù)檢測(cè)速度快，無(wú)需擔(dān)心樣品在檢測(cè)期間發(fā)生變化從而影響結(jié)果。檢測(cè)靈敏度高，不僅僅依賴于單一指標(biāo)，成功表征了蛋白聚集體與離子間的相互作用。并且還能反饋樣品聚集信息，這個(gè)功能是其他技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

NanoTemper 的分子互作檢測(cè)儀 Monolith，旨在助力研究人員加速神經(jīng)退行性疾病的藥物開發(fā)流程。A future with no disease 更是 NanoTemper CEO 矢志不渝的愿景。

參考文獻(xiàn)：

1. Kayed, R. et al. Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis. Science 300, 486–489(2003)?

2. Zn2+Aggravates Tau Aggregation and Neurotoxicity. Li et al., Int. J. Mol. Sci. 2019,?20, 487