當(dāng)我們獲得一種新型材料或者一種藥物時，就想迫不及待的知道其對細胞的安全性，但是細胞活性檢測方法那么多，讓人感覺無著手，真是令人頭大、令人心累呀(?ó﹏ò?)

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今天小木子就和大家一起學(xué)習(xí)檢測材料或藥品安全性的大法---細胞毒性檢測。讓科研人一起干起來!!!

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首先呢，讓我們一起了解下什么是細胞毒性檢測？

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細胞毒性檢測：利用細胞培養(yǎng)技術(shù)，采用細胞毒性試驗評價一種器材、材料或藥物引起的細胞死亡、細胞生長抑制或者細胞方面其他的影響。體外細胞毒性試驗具有通用性的特點，能夠廣泛適用于各種醫(yī)療器械和材料的評價。進而檢測樣品的材質(zhì)是否導(dǎo)致細胞損傷、細胞生長、細胞代謝變化，甚至引發(fā)死亡。常分為直接接觸實驗、間接接觸實驗、浸提液實驗三類。

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既然我們已經(jīng)知道細胞毒性檢測的定義，那么現(xiàn)在一起學(xué)習(xí)怎么樣才能進行檢測？

細胞毒性檢測主要是依據(jù)細胞膜通透性發(fā)生改變來進行檢測的。而常用的檢測方法有以下幾種：

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MTT檢測法；

CCK-8檢測法；

熒光素發(fā)光法檢測（ATP發(fā)光法）；

LDH法檢測；

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除了以上的檢測方法還有各種各樣的細胞毒性檢測方法，例如：細胞計數(shù)法、XTT、臺盼藍染色、Calcelin-AM/PI雙染等。

別急，小木子依次講解上面常用的檢測方法。

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MTT

MTT全稱為3-（4,5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，漢語化學(xué)名為3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二甲基四氮唑溴鹽，是一種黃顏色的染料。是一種檢測細胞存活和生長的方法。其主要原理為利用細胞線粒體內(nèi)部酶的活性，可以將特定的四唑鹽進行轉(zhuǎn)化，然后通過酶標(biāo)儀進行檢測。具體的原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚，沉積在細胞中，而死細胞沒有此功能。二甲基亞砜（DMSO）能夠?qū)⒊练e在細胞中的甲瓚溶解，形成紫色溶液，然后在酶聯(lián)免疫檢測儀中檢測570?nm波長處的OD值（也可用490?nm），可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。具有靈敏度高、經(jīng)濟、便捷的特點。

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CCK-8

CCK-8（Cell?Counting?Kit-8）檢測法，是用于測定細胞增殖或者細胞毒性試驗中活細胞數(shù)目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。CCK-8是一種氧化還原反應(yīng)的指示劑，該試劑中含有WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）能在電子載體1-Methoxy PMS存在的條件下，利用活細胞中的脫氫酶催化四唑鹽WST-8還原生成高度水溶性的黃色甲臜染料，而且甲臜染料的生成量與活細胞的數(shù)量成線性關(guān)系，即顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450?nm波長處測定OD值，進而間接反映活細胞數(shù)量。

CCK-8具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、可直接加入細胞樣品中，不需要與其他組分預(yù)混以及洗滌細胞、操作簡單便捷、無需有機溶劑、對細胞毒性小、檢測準(zhǔn)確等優(yōu)點。即可用于貼壁細胞也可用于懸浮細胞?；谝陨系膬?yōu)點，CCK-8檢測法應(yīng)用較為廣泛，如藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏實驗以及一些生物因子的活性檢測等。

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CCK-8工作原理圖如下：

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CCK-8?與MTT法檢測相比較優(yōu)缺點如下表：

檢測方法MTT法CCK-8法產(chǎn)品性狀粉末溶液生成甲瓚的水溶性差較好使用方法配成溶液后使用即開即用檢測靈敏度高較高檢測時間較長較短檢測波長560-600?nm430-490?nm便捷程度一般便捷細胞毒性高，細胞形態(tài)完全消失很低，細胞形態(tài)不變試劑穩(wěn)定性一般很好

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熒光素發(fā)光法（ATP發(fā)光法）

腺苷三磷酸（ATP adenosine triphosphate）是由腺嘌呤、核糖和3個磷酸基團連接而成，水解時釋放出能量較多，是生物體內(nèi)最直接的能量來源。內(nèi)源性ATP是活細胞最基本的能量來源，而細胞死亡時，ATP迅速水解。因此，測定細胞內(nèi)源性ATP的含量可以及時反映細胞活性和活細胞數(shù)量。

ATP發(fā)光法，是通過檢測細胞內(nèi)ATP含量來分析細胞活性及增殖的。常見的ATP發(fā)光法是利用外源螢火蟲熒光素/熒光素酶與細胞內(nèi)的ATP發(fā)生氧化反應(yīng)將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，通過監(jiān)測熒光強度來檢測ATP含量。在熒光素酶催化發(fā)光反應(yīng)中，ATP在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強度呈線性關(guān)系，將ATP數(shù)量化。具有靈敏、快速、便捷、穩(wěn)定特點。

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（圖片來自網(wǎng)絡(luò)）

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LDH法

LDH（乳酸脫氫酶）是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細胞的胞質(zhì)中，一旦細胞膜受損，LDH即被釋放到細胞外；LDH能夠催化乳酸形成丙酮酸鹽，和INT（四唑鹽類）反應(yīng)形成紫色的結(jié)晶物質(zhì)，可通過酶標(biāo)儀進行檢測500 nm波長處的OD值。因此可通過檢測細胞培養(yǎng)上清中LDH的酶活性，可判斷細胞受損的程度，進而檢測細胞毒性。

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通過以上的學(xué)習(xí)，是否感覺自己收獲滿滿呢！在掌握了原理之后，是否蠢蠢欲動，迫不及待進行實驗操作，信心滿滿的安排自己的科研計劃呢，然后早日獲得實驗數(shù)據(jù)，爭取早日發(fā)表文章，早日脫離科研困擾。下期小木子在將給大家分享實驗步驟，注意事項，以及遇到的問題解決方法。

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