注：本文不構(gòu)成任何投資意見(jiàn)和建議，以官方/公司公告為準(zhǔn)；本文僅作醫(yī)療健康相關(guān)藥物介紹，非治療方案推薦（若涉及），不代表耀海生物立場(chǎng)。任何文章轉(zhuǎn)載需得到授權(quán)。

前言

在之前的文章中，菌菌帶領(lǐng)大家了解了關(guān)于中試放大部門(mén)生產(chǎn)流程的一些內(nèi)容，具體可參考耀海生物往期文章《【星耀避坑攻略】中試放大的生產(chǎn)流程》。

今天菌菌想給大家介紹一些關(guān)于中試放大發(fā)酵工藝中職責(zé)分解、實(shí)施及履行的內(nèi)容。

發(fā)酵工程

首先，我們要了解什么是微生物發(fā)酵。微生物發(fā)酵即是利用微生物在適宜的條件下，將原料經(jīng)過(guò)特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為人類(lèi)所需要的產(chǎn)物的過(guò)程。

發(fā)酵工業(yè)經(jīng)歷了四個(gè)歷史階段，分別是原始發(fā)展階段、傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)階段、現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)階段和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)階段。原始發(fā)展階段多為家庭式作坊，用于釀酒等，不知曉其中原理；傳統(tǒng)發(fā)酵工藝階段時(shí)人們才逐漸了解發(fā)酵現(xiàn)象的本質(zhì)，生產(chǎn)過(guò)程也較為簡(jiǎn)單，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備的要求不高、規(guī)模不大；現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)階段對(duì)生產(chǎn)技術(shù)要求比前面兩個(gè)階段要高，生產(chǎn)規(guī)模也更大，技術(shù)發(fā)展速度更快，菌種株的生產(chǎn)能力也大幅提升，此時(shí)新產(chǎn)品、新技術(shù)、新設(shè)備的應(yīng)用達(dá)到了前所未有的程度；最后是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)階段，也是目前行業(yè)內(nèi)新興的科技手段，即利用構(gòu)建的基因工程菌進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，來(lái)達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需。

圖1 菌種株發(fā)酵流程和發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)示意圖

中試放大的重要性

常規(guī)理解中，我們都認(rèn)為中試放大的本質(zhì)是在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模生產(chǎn)工藝路線(xiàn)打通后，采用該工藝在模擬工業(yè)化生產(chǎn)的條件下所進(jìn)行的工藝研究。其實(shí)不然，中試放大的作用不僅如此。

在詢(xún)問(wèn)過(guò)中試放大的資深老師后，菌菌得到了如下答案：中試放大是以小試工藝為基礎(chǔ)，以商業(yè)化生產(chǎn)為目的去設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)中間部門(mén)，有著承上啟下的作用。

中試放大部門(mén)從小試工藝中獲得實(shí)驗(yàn)方案后，第一批工藝先驗(yàn)證小試的工藝是否可行，按照小試工藝條件進(jìn)行放大，檢測(cè)是否能滿(mǎn)足商業(yè)化生產(chǎn)的需求；第二批及第三批等工藝即需要將小試工藝和商業(yè)生產(chǎn)相結(jié)合，判斷工藝放大中是否有其他因素影響工藝的生產(chǎn)，充分考慮車(chē)間設(shè)備、環(huán)境等因素。若有即對(duì)小試工藝進(jìn)行修訂，直至成功實(shí)行工藝放大；如修訂后商業(yè)化生產(chǎn)仍不能順利進(jìn)行，中試部門(mén)即需要重新制定適合商業(yè)化生產(chǎn)的工藝，待符合要求后進(jìn)行工藝轉(zhuǎn)移。

除上述外，中試部門(mén)還起著數(shù)據(jù)積累的作用。每做一批項(xiàng)目，中試都將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納整合，分析項(xiàng)目進(jìn)行過(guò)程中所產(chǎn)生的問(wèn)題。在此菌菌向老師請(qǐng)教了具體事例來(lái)進(jìn)行分析，例如：一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中小試工藝中的發(fā)酵使用的培養(yǎng)容器一般是量筒，量少且精確度高；但在商業(yè)化生產(chǎn)中因?yàn)槲锪狭看螅Ｊ褂梅Q(chēng)重的方式進(jìn)行稱(chēng)量，然后再進(jìn)行溶液配制。因?yàn)槲锪狭看?，發(fā)酵中可能會(huì)產(chǎn)生一系列小試工藝中不曾出現(xiàn)的問(wèn)題，即需要中試放大在一批批工藝試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，積累數(shù)據(jù)，然后解決問(wèn)題。

綜上所述，中試放大的重要性可用八個(gè)字來(lái)概括“求同存異，數(shù)據(jù)積累”。將小試工藝和商業(yè)化生產(chǎn)當(dāng)中皆可使用的工藝流程進(jìn)行驗(yàn)證保留，不可進(jìn)行放大生產(chǎn)的工藝進(jìn)行修訂直至符合商業(yè)化生產(chǎn)的要求；在每一批項(xiàng)目中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納整理并留取樣品，方便之后的商業(yè)化生產(chǎn)中出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)可及時(shí)找出原因。

中試發(fā)酵流程

接下來(lái)菌菌帶領(lǐng)大家看看中試放大過(guò)程中發(fā)酵部分的流程。在中試放大中我們常會(huì)使用到經(jīng)驗(yàn)放大的研究方法，主要流程是通過(guò)逐級(jí)放大來(lái)摸索反應(yīng)器的特征，實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)室裝置到中間裝置、中型裝置和大型裝置的過(guò)渡。

微生物工藝中通常使用大腸桿菌作為菌種，是市面上較為成熟的工藝開(kāi)發(fā)菌種。廣義上來(lái)說(shuō)，現(xiàn)代發(fā)酵工程由三部分組成：上游工程、中游工程和下游工程。

圖2 耀海生物中試發(fā)酵罐

1、前期準(zhǔn)備工作

在我們進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前，我們需要穿上下分體式潔凈服，佩戴一次性帽子、口罩、手套，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前使用酒精消毒，中試放大的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境一般為D級(jí)潔凈區(qū)。在正式實(shí)驗(yàn)之前，我們應(yīng)該首先確定工藝文件的內(nèi)容是否符合要求，核查記錄與方案的內(nèi)容是否一致，是否存在漏寫(xiě)或者二者在關(guān)鍵工藝上的不同。在核查完工藝文件后，再根據(jù)工藝文件對(duì)所需要的物料（廠家、貨號(hào)一致）、儀器、耗材進(jìn)行核查，進(jìn)行物料的申領(lǐng)。然后使用天平進(jìn)行物料稱(chēng)量，進(jìn)行培養(yǎng)基的配制。培養(yǎng)基一般有固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，固體常為瓊脂培養(yǎng)皿，液體培養(yǎng)基中常見(jiàn)成分為蛋白胨加酵母粉，培養(yǎng)基中一般會(huì)加入抗生素進(jìn)行菌株篩選。星耀小TIP：在此菌菌想給一個(gè)小貼士：固體培養(yǎng)基的配置與普通培養(yǎng)基相同，均是先稱(chēng)料、溶解、滅菌。與普通培養(yǎng)基不同的是，固體培養(yǎng)基在滅菌冷卻時(shí)，不可直接冷卻至室溫，應(yīng)在冷卻至60?℃左右時(shí)，加入抗生素并震蕩均勻（若在較高溫度下加入抗生素，容易使抗生素失活，如果加入溫度過(guò)低，容易使固體培養(yǎng)基凝固，不方便轉(zhuǎn)移）。

在此菌菌給大家詳細(xì)講述一下固體培養(yǎng)基制備的操作步驟噢，請(qǐng)跟隨菌菌一同往下看：

首先左手取無(wú)菌的培養(yǎng)皿一個(gè)，用拇指和食指控制皿蓋，其余幾指控制皿底。

打開(kāi)皿蓋，使開(kāi)口角小于30 °，靠近點(diǎn)燃酒精燈。右手傾倒固體培養(yǎng)基（液體），注意瓶口不可與培養(yǎng)皿接觸。制備固體培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)該注意減少左手的抖動(dòng)以避免固體培養(yǎng)基有氣泡產(chǎn)生。待培養(yǎng)基完全覆蓋培養(yǎng)皿底部時(shí)停止傾倒，合上培養(yǎng)皿蓋子并輕輕放在生物柜實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。菌菌整理收納了關(guān)于中試生產(chǎn)流程的一些資料，如有需要可后臺(tái)私信菌菌進(jìn)行領(lǐng)取噢~

圖3 固體培養(yǎng)基操作圖

目前耀海生物具備提供從原始庫(kù)到工作庫(kù)的建立的服務(wù)能力，RCB建庫(kù)的法規(guī)要求“建立RCB需保證可溯源性，GMP體系下生產(chǎn)對(duì)RCB來(lái)說(shuō)為非必須條件，而MCB和WCB必須在GMP車(chē)間內(nèi)完成”，而耀海生物擁有成熟的RCB建庫(kù)環(huán)境和有獨(dú)立的GMP級(jí)別菌種建庫(kù)車(chē)間，以及同時(shí)具備GMP體系生產(chǎn)條件?？杀苊舛嗥贩N運(yùn)行時(shí)的交叉污染，以及在同時(shí)服務(wù)多條管線(xiàn)時(shí)，有獨(dú)立的GMP級(jí)別菌種建庫(kù)車(chē)間可以不受車(chē)間服務(wù)排產(chǎn)的影響。

星耀小TIP：蛋白胨常應(yīng)用于微生物和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，外觀以淡黃至棕黃色粉劑為主。目前蛋白胨的來(lái)源主要為動(dòng)物性蛋白胨和植物性蛋白胨。但由于動(dòng)物源蛋白胨不順應(yīng)生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，以及動(dòng)物源蛋白胨的成分復(fù)雜，追溯困難，國(guó)際上FDA和藥典中心呼吁使用植物源蛋白胨代替動(dòng)物源蛋白胨進(jìn)行生物制品的制作。

2、種子液制備

將滅菌后的菌種復(fù)蘇培養(yǎng)基置于生物安全柜中，開(kāi)啟紫外燈照射三十分鐘，我們使用中的安全柜一般都是254 nm波長(zhǎng)的紫外線(xiàn)，254 nm的紫外可以進(jìn)行有效的殺滅細(xì)胞類(lèi)的細(xì)菌或者病毒。然后在火焰保護(hù)下像菌種復(fù)蘇培養(yǎng)基中加入抗生素，該操作的目的是保證菌液始終保持在無(wú)菌條件下進(jìn)行。所有滅菌程序，以殺滅芽孢為標(biāo)準(zhǔn)。再將所需的工作菌種接種到培養(yǎng)基中，進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)。星耀小TIP：芽孢又稱(chēng)內(nèi)生孢子，是細(xì)菌休眠體。產(chǎn)芽孢細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)條件缺乏時(shí)，在菌體內(nèi)形成圓形或橢圓形的芽孢休眠體。芽孢含水量極低,抗逆性強(qiáng)，能經(jīng)受高溫、紫外線(xiàn)，電離輻射以及多種化學(xué)物質(zhì)滅殺等，在滅菌監(jiān)測(cè)中，可利用芽孢的高抗逆性制備生物指示劑。

圖4 菌液滅菌完成后放置于生物柜中并照射紫外光線(xiàn)

在中試放大生產(chǎn)過(guò)程中，種子液一般取從小試工藝中的三級(jí)種子進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，故在此不過(guò)多贅述。如對(duì)種子液培養(yǎng)相關(guān)情況不夠了解可后臺(tái)私信菌菌獲取資料噢~

3、發(fā)酵

在開(kāi)始發(fā)酵前，我們需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒，為防止發(fā)酵中的雜菌和噬菌體產(chǎn)生。車(chē)間消毒液主要為75%的酒精，苯扎溴銨溶液。苯扎溴銨是一種消毒殺菌劑，在使用后能夠有效的改變細(xì)胞的通透性，使細(xì)胞的物質(zhì)滲出能阻止代謝，能起到很好的殺菌作用。

耀海生物擁有GMP環(huán)境的車(chē)間，即整潔的生產(chǎn)環(huán)境，廠區(qū)的地面、路面及運(yùn)輸?shù)炔粫?huì)對(duì)制品的生產(chǎn)造成污染，生產(chǎn)、行政、生活和輔助區(qū)的總體布局合理，廠區(qū)和廠房?jī)?nèi)的人、物流走向應(yīng)當(dāng)合理。耀海生物廠房所處的環(huán)境能夠盡量降低物料或產(chǎn)品遭受污染。

圖5 噴灑苯扎溴銨溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和環(huán)境進(jìn)行消毒

在發(fā)酵罐滅菌前發(fā)酵罐pH計(jì)的標(biāo)定校準(zhǔn)，一般采用兩點(diǎn)校準(zhǔn)法，用pH4.00和Ph6.86的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液對(duì)pH電極進(jìn)行校準(zhǔn)。然后將配制好的發(fā)酵液放置于發(fā)酵罐中。一般來(lái)說(shuō)，一般來(lái)說(shuō)pH標(biāo)準(zhǔn)液要定期更換（1周更換一次，開(kāi)封后的標(biāo)準(zhǔn)液保質(zhì)期為3個(gè)月）。且發(fā)酵液體積一般為發(fā)酵罐體積的1/2左右，保證罐內(nèi)有充足的溶氧和后續(xù)可加入補(bǔ)料的條件。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制完畢后進(jìn)行定容，發(fā)酵罐檢驗(yàn)底閥是否關(guān)閉，確認(rèn)底閥關(guān)閉后將發(fā)酵罐培養(yǎng)液加入（根據(jù)發(fā)酵液具體情況判斷）發(fā)酵罐中。待pH穩(wěn)定且三級(jí)種子培養(yǎng)達(dá)到目標(biāo)OD600值的時(shí)候，進(jìn)行發(fā)酵罐接種，用酒精棉擦拭接種位置，在火焰保護(hù)下接種，然后將一級(jí)發(fā)酵液全部倒入發(fā)酵罐中，接種完畢后運(yùn)行發(fā)酵罐發(fā)酵程序。

發(fā)酵過(guò)程中時(shí)刻注意發(fā)酵罐儀表盤(pán)上的參數(shù)情況，溫度使用機(jī)器自控溫度，溶氧根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體需要進(jìn)行控制，留意發(fā)酵罐內(nèi)情況，每小時(shí)進(jìn)行一次取樣，取得的樣品放入分光光度計(jì)中進(jìn)行OD600值的測(cè)量并記錄參數(shù)。當(dāng)OD600值達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康臅r(shí)進(jìn)行下罐處理，進(jìn)行菌液的收集。

總結(jié)

從實(shí)驗(yàn)室工藝到工業(yè)生產(chǎn)，中試放大是必不可少的過(guò)程。中試放大一方面驗(yàn)證和完善實(shí)驗(yàn)室工藝（亦稱(chēng)小試）所確定的反應(yīng)條件，另一方面研究確定工業(yè)化生產(chǎn)所需設(shè)備的結(jié)構(gòu)、材質(zhì)、安裝以及車(chē)間布局等。通過(guò)中試放大，不僅可以得到先進(jìn)、合理的生產(chǎn)工藝，而且獲得較確切的消耗定額，為物料平衡、能量平衡、設(shè)備設(shè)計(jì)以及生產(chǎn)管理提供必要的數(shù)據(jù)。

那么關(guān)于中試放大發(fā)酵工藝的注意事項(xiàng)和具體操作流程，菌菌今天就跟大家分享到這里啦，如果讀者還有其他疑惑的話(huà)可以后臺(tái)私信菌菌噢~下一篇菌菌將帶領(lǐng)大家了解關(guān)于中試放大純化工藝的職責(zé)分解、實(shí)施及履行內(nèi)容。

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