上期給大家介紹了分子克隆的概念、原理以及通用實驗流程，相信大家已經(jīng)對分子克隆技術應該有一定了解了，詳見 “分子克隆技術全攻略” 。本期小愛將為大家講解分子克隆的載體——質粒。走！瞅瞅去!?

分子克隆技術運用的載體只要是指將DNA片段（目的基因）轉移至受體細胞的一種能自我復制的DNA分子工具。常見的載體主要有質粒、噬菌體、病毒等。今天咱們要聊的主角是質粒。

一、什么是質粒？

天然質粒是可獨立于染色體外可自行復制的環(huán)狀DNA分子，通常帶有一些基因，特別是一些與抗生素耐藥性有關的基因，可以在不同的細菌細胞之間傳遞。質粒主要存在于細胞、古生菌及真核生物中，比較特殊的在植物的葉綠體和線粒體等胞器中也有出現(xiàn)。

研究報道指出質粒也不全是環(huán)狀的哦！1984年，在Streptomyces coelicoler（天藍色鏈霉菌）等放線菌以及在Borrelia hermsii（赫氏蜱疏螺旋體）等原核生物中，又相繼發(fā)現(xiàn)線形質粒?；谫|粒能夠攜帶基因，并且能夠在不同細胞中傳代基因的特性，質粒被運用到分子克隆技術中。在分子克隆技術中運用的質粒載體是在天然質粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工改造得來，通常所用的是細菌載體質粒。

它在分子克隆技術中的運用是將某種目標基因片段重組到質粒中，構成重組基因或重組體。將這種重組體經(jīng)微生物學的轉化技術，轉入受體細胞（如大腸桿菌）中，使重組體中的目標基因在受體菌中得以繁殖或表達，從而改變寄主細胞原有的性狀或產生新的物質。

細菌質粒是基因工程中最常用的載體，這些質粒至少要有復制起點、篩選標記和克隆位點。基礎的部分我們都來詳細了解下。

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二、質粒結構原件有哪些？

圖1?質粒圖譜

1）復制起始位點(Origin of Replication，ORI)

ORI是一段DNA序列，質粒復制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用于這段序列，然后DNA的雙鏈被分開，復制隨即開始。質粒必須是能夠復制的，否則隨著細菌的生長，質粒的數(shù)量將會被迅速稀釋。

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2）抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Gene)

抗生素抗性基因存在作用是快速篩選。在含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌，能夠生長的就是含有目的質粒，不含質粒的細菌已經(jīng)被“殺死”了。

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3）篩選標記(Selectable Marker)

篩選已經(jīng)成功攝取質粒的細胞。該篩選標記需要區(qū)別于細菌中的抗性篩選。細菌抗性基因篩選用于質粒擴增過程，篩選標記用于篩選或標記轉染后的細胞。篩選標記通常是抗性篩選或者熒光蛋白。

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4）啟動子(Promoter)

啟動子是能夠使基因進行轉錄的一段DNA序列。啟動子可以被RNA聚合酶辨別，并開始轉錄。啟動子常位于目的基因上游100-1000bp位置處，是質粒非常重要的一個元件，它決定著目的基因可以在何種細胞中進行表達，也決定蛋白質的表達量。

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5）多克隆位點(Multiple Cloning Site, MCS)

多克隆位點是一段短DNA片段，包括多個限制性酶切的單一位點，便于外源基因的插入。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉化效率越低。在表達型質粒中，MCS常處于啟動子的后面。

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6）引物結合位點(Primer Binding Site)

引物結合位點為一小段DNA片段，用來進行質粒的PCR擴增或者測序。

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7）插入片段(Inserted Gene)

插入片段又稱為外源性基因，是克隆到MCS中的基因、啟動子或其他DNA片段，通常是人們所希望研究的遺傳元件。

三、質粒的分類有哪些？

1）表達質粒：用于基因表達（基因功能的研究）。表達載體必須包含啟動子、轉錄終止子序列和插入基因。啟動子驅動插入DNA轉錄生成RNA，合成的RNA上的終止子序列發(fā)出停止轉錄過程的信號。表達載體可以通過增強子序列增加蛋白質或RNA的產量。表達載體可以在各種細胞類型（哺乳動物、酵母、細菌等）中驅動表達，這在很大程度上取決于用于啟動轉錄的啟動子。

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2）克隆質粒：用于促進DNA片段的克隆?？寺≥d體往往非常簡單，通常只包含細菌抗性基因、復制起點和MCS。

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3）報告質粒：用于研究遺傳元件的功能。這些質粒包含一個報告基因（例如，熒光素酶或GFP），可提供遺傳元件活性的讀數(shù)。愛必信的快速多片段DNA組裝預混液（abs60250）可以直接用于報告基因質粒的構建。同時我們還有一系列的熒光素酶報告基因檢測試劑盒：abs60341、abs60342、abs60343、abs60344供大家選擇。

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4）病毒質粒：通過修飾的病毒基因組，有效地將遺傳物質遞送到靶細胞中?？梢允褂眠@些質粒來制造病毒顆粒，例如慢病毒、逆轉錄病毒、AAV或腺病毒顆粒，從而高效感染靶細胞。

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5）基因敲減質粒：用于減少內源基因的表達。通過表達靶向目的基因mRNA的shRNA來實現(xiàn)。這些質粒具有可以驅動短 RNA 表達的啟動子。

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6）基因工程質粒：用于靶向和編輯基因組。通常使用CRISPR技術完成。

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