????????掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)測(cè)試樣品的基本要求是干燥且導(dǎo)電性好。然而，微生物樣品含水量高，導(dǎo)電性差，且容易變形。因此，對(duì)微生物樣品進(jìn)行SEM測(cè)試之前需要對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的前處理。

注：本文提供的方法對(duì)其他生物樣品同樣適用。

采用SEM表征微生物樣品的制樣步驟如下：

(1) 取樣：取一定量的菌液8000×g離心10 min，棄上清取沉淀進(jìn)行下一步處理。

離心力大小和離心時(shí)間問題：8000×g、13000×g或者其他適當(dāng)?shù)碾x心力都可以，這步的主要目的是使菌沉淀。如果菌液比較少且濃度低，就需要使用更高的離心力和適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間。

菌液沉淀量的問題：不需要多少沉淀，一般情況下50 ml菌液離心的沉淀完全足夠。

(2) 固定：將沉淀用2.5%的戊二醛固定4 h（或4 ℃過夜），然后用0.2 M PBS緩沖液（PH=6.8）清洗3次，每次15-20min。

固定時(shí)間問題：如果時(shí)間允許則4℃過夜，測(cè)試比較著急的情況下4 h也可以。

固定和清洗問題：因?yàn)槭浅恋?，這里面有一個(gè)問題是需不需要把菌分散開來固定和清洗?？梢苑稚㈤_，然后再離心沉淀進(jìn)行下一步處理，但是比較麻煩。也可以不分散開，親自實(shí)驗(yàn)證明可行，對(duì)最終成像也沒有發(fā)現(xiàn)太大區(qū)別。

沉淀分散問題：在固定和清洗過程中如果沉淀自然分散開，可以通過再離心的方式沉淀。下同。

鋨酸問題：有些文獻(xiàn)還使用了1%的鋨酸固定，但是鋨酸劇毒且不好買，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都沒有。少了這步處理親自實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可行。

(3) 脫水：用30%、50%、70%、85%和95%的乙醇各處理一次，每次15-20min；再用100%乙醇處理兩次，每次15-20min。

(4) 置換：用乙酸異戊脂置換3 h以上，最好過夜。使用乙酸異戊脂的目的是使菌更飽滿，避免菌出現(xiàn)變形或者皺縮。

置換時(shí)間：有些文獻(xiàn)置換時(shí)間為15 min，時(shí)間太短，容易造成菌的變形和皺縮。必須置換3 h以上。

(5) 觀察：將樣品依次經(jīng)過二氧化碳臨界點(diǎn)干燥和離子濺射儀噴金后，用掃描電子顯微鏡觀察、拍照。

二氧化碳臨界點(diǎn)干燥問題：有些文獻(xiàn)使用了空氣自然干燥，或者冷凍干燥，但是如果實(shí)驗(yàn)條件允許，建議使用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥。

噴金相關(guān)問題：噴金的目的是使樣品導(dǎo)電。微生物樣品導(dǎo)電性差，建議延長(zhǎng)噴金時(shí)間。在一般樣品噴金60 s的基礎(chǔ)上適當(dāng)增加10-20 s。噴金時(shí)間也不是越長(zhǎng)越好，因?yàn)殡S著噴金時(shí)間的增長(zhǎng)，金膜的厚度越大，對(duì)于樣品的微觀細(xì)節(jié)影響也越大。因此，需要在導(dǎo)電性和減少對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的破壞之間平衡。

噴鉑問題：鉑顆粒比金小，因此對(duì)樣品微觀結(jié)構(gòu)的破壞比金小，但導(dǎo)電性比金差，也比金貴。對(duì)于微生物幾微米的尺寸來說，噴金就可以。

鑠思百檢測(cè)結(jié)果展示：