上期我們介紹了感染神經(jīng)系統(tǒng)的常見注射方法。本期主要介紹感染肝臟的注射方法，使用AAV8或AAV9尾靜脈注射和腹腔注射是常用的系統(tǒng)性感染方法。此外，還有靶向性更強(qiáng)的肝實(shí)質(zhì)注射、肝門靜脈注射和脾包膜內(nèi)注射三種感染方法，本期將主要介紹這三種方法，部分方法有附上視頻教程鏈接哦，小伙伴可直接將網(wǎng)址復(fù)制到瀏覽器中觀看學(xué)習(xí)~

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圖1 感染肝臟的肝內(nèi)、脾內(nèi)和門靜脈輸送途徑示意圖

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肝實(shí)質(zhì)注射操作步驟[1]：

1、麻醉小鼠，在小鼠的眼睛上涂上眼藥膏，防止眼干；

2、使小鼠仰臥，腹部朝上，對第二肋骨和第四乳頭之間的區(qū)域進(jìn)行脫毛處理；

3、對脫毛區(qū)域進(jìn)行消毒，用手術(shù)刀劃開腹部正中區(qū)域暴露肝左外葉；

4、使用29G針頭胰島素注射器吸取病毒液緩慢注射到肝實(shí)質(zhì)中，選擇3-5個(gè)不同的位點(diǎn)注射，總量100-200μL；

注：在注射過程中通過手術(shù)立體鏡監(jiān)測注射部位，如果觀察到被膜下出血或注射物外滲，需取出針頭，用無菌棉輕輕按壓止血，然后選擇另一個(gè)部位進(jìn)行注射。

5、用無菌棉輕輕按壓止血，4-0線縫合傷口；

6、將小鼠放回籠中，保持小鼠身體足夠溫暖，以利于蘇醒。

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肝門靜脈注射操作步驟[2]：

1、注射前1h麻醉小鼠，在小鼠的眼睛上涂上眼藥膏，防止眼干；

2、使小鼠仰臥，腹部朝上，對第二肋骨和第四乳頭之間的區(qū)域進(jìn)行脫毛處理；

3、對脫毛區(qū)域進(jìn)行消毒，用手術(shù)刀劃開第二肋骨和第四乳頭之間的區(qū)域，長度約3cm，注意不要傷及乳腺、腸道、肝臟等其他組織；

4、用消毒棉簽小心把大小腸等內(nèi)臟拉出來，用紗布輕輕遮蓋防止觸碰，找到肝門靜脈；

5、事先用32G針頭注射器吸入50-100μL病毒液，在肝臟下方距離約1cm的位置，以小于5°的夾角沿著肝門靜脈緩緩插入3-5mm；

6、緩慢注射病毒液，注射完畢停留3-5s再拔出針頭并用棉簽輕輕按壓片刻，接著用止血棉覆蓋肝門靜脈；

7、用棉簽輕輕按壓5min止血，這一步務(wù)必確保止血完成，否則繼續(xù)按壓，直至止血完成；

8、拿出止血棉，若止血棉與組織粘連嚴(yán)重可用無菌PBS濕潤；

9、將拉出的臟器輕輕歸位，4-0線縫合傷口，10-15針；

10、將小鼠放回籠中，保持小鼠身體足夠溫暖，以利于蘇醒。

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視頻教程：https://mp.weixin.qq.com/s/lLKNTlAeteqw63h2ejrG7A

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脾包膜內(nèi)注射操作步驟[3]：

1、注射前1h麻醉小鼠，在小鼠的眼睛上涂上眼藥膏，防止眼干；

2、使小鼠仰臥，腹部朝上，對手術(shù)區(qū)域進(jìn)行脫毛處理；

3、對脫毛區(qū)域進(jìn)行消毒，用手術(shù)刀在腹部左側(cè)劃開一個(gè)長度約1cm的切口，暴露脾臟；

4、用30G針頭注射器吸入100μL（1×1011vg）病毒液，于脾包膜下注射；

5、用無菌棉輕輕按壓止血，3-0線縫合傷口；

6、將小鼠放回籠中，保持小鼠身體足夠溫暖，以利于蘇醒。

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表1 不同注射方法的優(yōu)缺點(diǎn)和病毒用量

以上就是感染肝臟常用的直接注射方法，AAV8或AAV9搭配TBG啟動(dòng)子尾靜脈注射或腹腔注射同樣可以實(shí)現(xiàn)肝臟特異性感染，另外漢恒生物還可提供alb、Apoe肝臟特異性啟動(dòng)子，小伙伴可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的啟動(dòng)子。更多關(guān)于肝臟感染的問題歡迎咨詢漢恒生物！

參考文獻(xiàn)

[1]?Sferra, Thomas J., Backstrom, Kristin., Wang, Chuansong., Rennard, Rachel., Miller, Matt.. ?Widespread correction of lysosomal storage following intrahepatic injection of a recombinant adeno-associated virus in the adult MPS VII mouse. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy, 2004, 10(3):478-91.

[2]?Sherman, Alexandra., Schlachterman, Alexander., Cooper, Mario., Merricks, Elizabeth P., Raymer, Robin A.. Portal vein delivery of viral vectors for gene therapy for hemophilia. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2014, 1114.

[3]?Nakai, H., Herzog, R W., Hagstrom, J N., Walter, J., Kung, S H.. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer of human blood coagulation factor IX into mouse liver. Blood, 1998, 91(12):4600-7.