單細胞Plus是結(jié)合單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）與單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序（snRNA-seq），兼顧兩者優(yōu)勢，相得益彰，從而揭示更系統(tǒng)全面、深入精準的生物學機制的研究方法。下面通過幾個典型文獻案例來為您揭曉其中的緣由與奧秘。

生命現(xiàn)象的本質(zhì)是復(fù)雜的細胞互作網(wǎng)絡(luò)，類型各異的細胞相互通訊并執(zhí)行特定功能，從而展現(xiàn)出豐富多彩的生理活動或狀態(tài)各異的病理活動。單細胞測序，特別是單細胞轉(zhuǎn)錄組檢測，通過在分子網(wǎng)絡(luò)層面解析和鑒定細胞功能，回溯和還原組織內(nèi)部的細胞網(wǎng)絡(luò)，明確細胞的分子調(diào)控模式和狀態(tài)變化，從而洞察生命現(xiàn)象背后的機制，業(yè)已成為生命科學研究中最強有力的技術(shù)手段。

由于技術(shù)上的限制，scRNA-seq（這里特指使用完整細胞進行的檢測）會造成細胞類型偏好性、應(yīng)激基因偏好等缺陷，因此，學界轉(zhuǎn)而利用snRNA-seq來避免這些不足。但snRNA-seq通常檢測到的是組織中占有優(yōu)勢比例的細胞類型，例如心臟組織中大量獲得的是心肌細胞，腦組織中獲得的是神經(jīng)元等等，這對一些課題造成了阻礙，例如更多關(guān)注免疫細胞功能的研究，因為很難捕獲這些細胞類型而無法進行深入的分析。

基于各自技術(shù)的優(yōu)勢與劣勢，目前學界逐步開始采用scRNA-seq與snRNA-seq結(jié)合的方式（我們稱之為單細胞Plus）來開展單細胞的轉(zhuǎn)錄組研究，取得了很好的效果，具體體現(xiàn)在以下三個方面：

“應(yīng)有盡有”

細胞Plus最直觀的優(yōu)點，就是獲得的細胞圖譜更完整，細胞類型應(yīng)有盡有。例如在人類脂肪組織的研究中，snRNA-seq補充了Adipocyte、Mesothelium，并獲得了更多的細胞數(shù)量【1】（圖1）。同樣的，在心臟組織中，snRNA-seq捕獲了Endocardium、Cardiomyocytes等scRNA-seq缺少的細胞類型，使細胞圖譜更加完整和全面【2】（圖2）。而在肝臟中也取得了同樣的良好效果【3】。因此，單細胞Plus能夠解決scRNA-seq長期存在的細胞偏好性問題，收獲更全面、更系統(tǒng)的細胞圖譜。

另外，單細胞Plus更有助于挖掘稀有細胞類型或細胞亞型，例如對脂肪細胞不同亞型與各項疾病或身體指標的關(guān)聯(lián)性分析，揭示了占比較少的細胞亞型與二型糖尿病高度相關(guān)【1】（圖3）。通過這種“細致入微”的檢測與分析，單細胞Plus能夠解答更多樣、更深入的生物學問題，并揭示其背后的分子機制，為高水平研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

圖1??人類脂肪組織單細胞Plus圖譜

scRNA-seq與snRNA-seq的結(jié)合在脂肪組織中捕獲了更為完整的細胞類型。引自【1】。

圖2??人類心臟組織單細胞Plus圖譜

scRNA-seq與snRNA-seq的結(jié)合在心臟組織中揭示了更豐富的細胞類型。引自【2】。

圖3??人類白色脂肪細胞各亞型與不同疾病或身體指標之間的相關(guān)性分析

對白色脂肪細胞的獨立分析顯示其可以進一步劃分為7個亞型，其中hAd7亞型與二型糖尿病高度相關(guān)，能夠顯著影響患病風險，盡管其數(shù)量僅占所有脂肪細胞的1%。引自【1】。

“洞察新機”

除了獲得更全面的細胞圖譜，借助分析scRNA-seq與snRNA-seq轉(zhuǎn)錄組的異同，單細胞Plus還能揭示全新的細胞調(diào)控機制。

在對果蠅精細胞發(fā)育的研究中，作者基于已知的干細胞會在細胞質(zhì)中儲存部分RNA，從而影響子代細胞分化的現(xiàn)象，通過對比scRNA-seq與snRNA-seq中轉(zhuǎn)錄本的異同，揭示了特定基因在精細胞發(fā)育過程中所扮演的特異性的調(diào)控作用【4】（圖4）。類似的，在對蜘蛛胚胎的分析中，作者對比scRNA-seq數(shù)據(jù)，在snRNA-seq中鑒定到了獨特的細胞類群，進一步的分析表明這個類群代表了細胞分化的一個過渡狀態(tài)，這樣就在整體上更加“動態(tài)”的解析了胚胎細胞的發(fā)育軌跡【5】（圖5）。

這些基因的鑒定及其所“預(yù)示”的分子機制，為我們理解細胞命運分化、功能改變等提供了全新的視角，相比單獨采用scRNA-seq或snRNA-seq，能夠獲得更多不同層面的細胞調(diào)控機制。因此，在單細胞轉(zhuǎn)錄組研究越來越多的當下，單細胞plus能夠帶來更多差異化的創(chuàng)新點，拓寬課題探索的范圍，增加研究的深度，幫助我們?nèi)〉酶路f和更廣泛的突破。

圖4??單細胞Plus解析干細胞分化的調(diào)控基因

熱圖展示了隨著細胞分化的進行（圖片上部橫軸顯示的時期），同樣的基因在scRNA-seq與snRNA-seq數(shù)據(jù)中擁有不同的表達模式，提示這些基因在細胞分化過程中可能被儲存在細胞質(zhì)中以調(diào)控分化進程：如下半部分的warped?pseudotime圖示。引自【4】。（注：因圖片過大，熱圖僅展示了一部分）。

圖5??單細胞Plus揭示更細致的細胞狀態(tài)變化

通過scRNA-seq與snRNA-seq的對比揭示了更為動態(tài)的圖譜變化：snRNA-seq中cluster?9是外胚層細胞（mesodermal cell）的一種終末分化類群（posterior terminal cell population），暗示了一種正在出現(xiàn)的細胞狀態(tài)（emerging cell states）。引自【5】。

“因勢利導(dǎo)”

隨著成本的降低和數(shù)據(jù)的積累，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)成為生命科學研究的“常規(guī)工具”，未來的研究將越來越追求更全面、更深入、更豐富的細胞調(diào)控機制。從技術(shù)角度來說，單細胞Plus很好的貼合了這一趨勢，能夠幫助我們獲得更加系統(tǒng)的洞見。而從最“直觀”的邏輯角度來看，更多的細胞數(shù)量，意味著更多的生物學“故事”。因此，單細胞Plus將成為未來單細胞組學研究的重要方法。

例如近期的植物學研究，也開始采用單細胞Plus的方式【6】（圖6），通過scRNA-seq提供的深度以及snRNA-seq揭示的廣度，以纖毫畢現(xiàn)的精度展示了玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、狗尾草（Setaria viridis）三種植物的單細胞分辨率的泛轉(zhuǎn)錄組（pan-grass?transcriptome），為研究植物進化提供了更系統(tǒng)、更精準的圖譜，并為育種、作物改良等帶來了全新的見解與思路。

圖6??玉米根的單細胞Plus圖譜

scRNA-seq提供了深度，snRNA-seq揭示了廣度，匯總成了更系統(tǒng)的圖譜。引自【6】

參考文獻

1.A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 2022 Mar;603(7903):926-933

2.Single-cell transcriptomics reveals cell-type specific diversification in human heart failure.?Nat Cardiovasc Res. 2022 Mar;1(3):263-280

3.Single-Cell, Single-Nucleus, and Spatial RNA Sequencing of the Human Liver Identifies Cholangiocyte and Mesenchymal Heterogeneity. Hepatol Commun. 2022 Apr;6(4):821-840.

4.Emergent dynamics of adult stem cell lineages from single nucleus and single cell RNA-Seq of Drosophila testes. Elife. 2023 Feb 16;12:e82201

5.Reconstruction of the Global Polarity of an Early Spider Embryo by Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptome Analysis. Front Cell Dev Biol. 2022 Jul 22;10:933220.

6.A pan-grass transcriptome reveals patterns of cellular divergence in crops. Nature. 2023 May;617(7962):785-791.