前言

慢性阻塞性肺病 (COPD) 是一種流行的、常見(jiàn)的呼吸道疾病，具有顯著的發(fā)病率和死亡率，已成為全球第三大死亡原因。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腸道和肺部微生物群失調(diào)與 COPD 有關(guān)。研究表明，CD4+T 淋巴細(xì)胞的 2 種亞型輔助性T 細(xì)胞 Th17 與調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞 Treg 比例失衡與 COPD 有關(guān)。芪白平肺膠囊 (QBPF) 是我國(guó)臨床上治療 COPD 的一種中藥。然而，QBPF 干預(yù)對(duì)腸道 Th17/Treg 平衡和腸道與肺微生物群的影響仍然知之甚少。

近日，安徽中醫(yī)藥大學(xué)朱潔教授、李澤庚教授和復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所董競(jìng)成教授作為共同通訊作者，在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域權(quán)威期刊 Journal of Translational Medicine (IF：8.440) 上在線發(fā)表了題為〝The treatment of Qibai Pingfei Capsule on chronic obstructive pulmonary disease may be mediated by Th17/Treg balance and gut-lung axis microbiotan〞的研究論文，發(fā)現(xiàn)了 QBPF 的治療效果是可以通過(guò)維持免疫細(xì)胞平衡和調(diào)節(jié)腸-肺軸微生物群來(lái)實(shí)現(xiàn)，為探索 COPD 潛在的生物標(biāo)志物和 QBPF 治療 COPD 的可能機(jī)制提供了參考。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1、肺功能檢測(cè)及Th17 / Treg 細(xì)胞平衡分析

與對(duì)照來(lái)比，模型組大鼠體重增長(zhǎng)緩慢，精神不活躍，毛發(fā)凌亂，色澤無(wú)光澤，背部拱起；與模型組比較，QBPF組大鼠體重及其精神狀態(tài)和活動(dòng)均有不同程度的改善。同時(shí)檢測(cè)所有組的FEV 0.3、FVC和 (FEV 0.3 / FVC) %以反映肺功能。與對(duì)照組相比，COPD組和 QBPF 組這些指標(biāo)顯著降低(P < 0.01)（Fig.1）。經(jīng)過(guò)QBPF 治療后，顯著改善了COPD組大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)，并證實(shí) QBPF 治療可以緩解 COPD 的癥狀。

通過(guò)檢測(cè)外周血的 Th17 和 Treg 細(xì)胞占比情況來(lái)分析QBPF治療引起的免疫影響。與模型組相比，對(duì)照組和治療組的Tregs 顯著增加，Th17 細(xì)胞及Th17 / Treg 均顯著降低 (Fig.1) 。表明QBPF 在降低 Th17 細(xì)胞表達(dá)的同時(shí)可以增加Treg，通過(guò)降低 Th17 / Treg 來(lái)治療COPD。

Fig. 1 | 肺功能和外周血Th17和Treg細(xì)胞的比例

大鼠血清中Th17細(xì)胞和Tregs相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生了顯著變化，表明QBPF對(duì)大鼠COPD的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制炎癥因子和調(diào)節(jié)免疫相關(guān)細(xì)胞因子(Fig. 2)。此外，Th17細(xì)胞和Tregs的轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3在各組大鼠肺組織中的表達(dá)也發(fā)生了顯著變化，RORγt表達(dá)顯著升高，同時(shí)Foxp3 表達(dá)明顯降低。(Fig. 2)。免疫組化結(jié)果表明：與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，彈性降低，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大皰，也有許多炎性細(xì)胞。然而值得注意的是，通過(guò)QBPF治療明顯緩解COPD肺組織病理學(xué)損害，顯著降低RORγt表達(dá)，F(xiàn)oxp3表達(dá)則顯著升高 (Fig. 2) 。

Fig.2 | 與Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子

2、腸道和肺部微生物群的α和β多樣性分析? ??

為檢測(cè)COPD組大鼠腸道和肺菌群的變化，以及QBPF干預(yù)能否調(diào)節(jié)菌群，對(duì)大鼠腸道內(nèi)容物和支氣管肺泡灌洗液 (BALF) 樣本進(jìn)行16SrRNA測(cè)序。對(duì)不同組別腸道內(nèi)容物及BALF微生物的多樣性進(jìn)行分析，分析結(jié)果相似。α多樣性中模型組的物種均勻度都顯著低于對(duì)照組，QBPF治療雖然增加物種均勻度但并無(wú)顯著差異。β多樣性分析中，PCoA圖結(jié)果表明了3個(gè)組別的腸道微生物菌群明顯不同，QBPF組更接近對(duì)照組 (Fig. 3) 。以上結(jié)果均表明QBPF治療可以改善模型組大鼠腸道和肺菌群的組成結(jié)構(gòu)。

Fig.3 | 腸道內(nèi)容物 (A-C) 和BALF (D-F) 的微生物多樣性分析

3、腸道和肺部菌群的物種組成分析

為了研究3組腸道和肺菌群群落結(jié)構(gòu)的差異，分別分析了在門和屬水平上各組Top15的優(yōu)勢(shì)菌群。腸道菌群分析表明，3組中的優(yōu)勢(shì)門包括擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門。模型組的擬桿菌門和變形菌門的占比較對(duì)照組下降，而厚壁菌門比例上升。QBPF干預(yù)后，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門的變化進(jìn)一步加深。模型組Fusobacteria相對(duì)豐度較對(duì)照組降低，QBPF干預(yù)后增加 (Fig. 4)。在屬水平上，相對(duì)豐度大于2%的優(yōu)勢(shì)屬包括Prevotella_9、Lactobacillus、Prevotella_1、擬桿菌、Fusobacteria等。與對(duì)照組相比，模型組的Lactobacillus、Prevotellaceae_UCG-001、Fusobacteria表達(dá)下調(diào)，而QBPF組與模型組相比表達(dá)上調(diào)。與對(duì)照組相比，模型組Prevotella_9、Prevotella_1等水平較對(duì)照組上調(diào)，QBPF組與模型組相比下調(diào) (Fig. 5)。

對(duì)于肺部菌群來(lái)說(shuō)，Top 5的優(yōu)勢(shì)門是擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門、Tenericutes和放線菌門占3組總豐度的92%以上。模型組中的擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門和放線菌門的比例較對(duì)照下降，QBPF組則升高；模型組中Tenericutes水平上升，而QBPF組則下降 (Fig. 6)。在BALF中相對(duì)豐度超過(guò)2%的優(yōu)勢(shì)菌屬包括支原體、Prevotella_9、擬桿菌、乳桿菌屬、鏈球菌、鞘氨醇單胞菌和Prevotella_7。與對(duì)照組相比，在COPD模型組中，Prevotella_9、乳桿菌屬、鏈球菌、鞘氨醇單胞菌、Prevotella_7的比例下降，而在QBPF組比例上升。與對(duì)照組相比，模型組的支原體和擬桿菌菌水平較對(duì)照組升高，而QBPF組則下降 (Fig. 7)。

Fig.4 | 腸道細(xì)菌門水平上的物種分析

? Fig.5 | 腸道細(xì)菌屬水平上的物種分析

Fig.6 | 肺部細(xì)菌門水平上的物種分析??

?Fig.7 | 肺部細(xì)菌屬水平上的物種分析

4、腸道和肺部微生物群的顯著差異分析及微生物群的功能預(yù)測(cè)分析

LEfSe分析來(lái)篩選出組間豐度差異顯著的物種。在腸道菌群方面，與對(duì)照組相比，COPD組擬桿菌、厭氧菌、鐮刀菌、Blautia、Romboutsia等較豐富。而在QBPF組中，F(xiàn)usobacterium和Prevotellaceae_UCG_003豐度較高，而Fusicatenibacter、Neisseria、Acinetobacter、Mycoplasma、Blautia等 呈現(xiàn)出較低豐度 (Fig. 8)。

同時(shí)對(duì)肺菌群進(jìn)行LEfSe分析：與對(duì)照組相比，COPD 組中克雷白桿菌、鞘氨醇單胞菌、鏈球菌、乳桿菌、Mucilaginibacter、Delftia、葡萄球菌、假單胞菌、Lautropia、Massilia等含量較少。而在QBPF組中，Cetobacterium、Campylobacter、Aerococcus、Acetatifactor、 Pseudomonas、Neochlamydia、Sulfuritalea等豐度較高，而Promicromonospora、Duganella、 Herbaspirillum、Glaciecola、Eisenbergiella、Negativibacillus和支原體等菌屬豐度則低于COPD組 (Fig. 8)。

此外，進(jìn)行了腸道菌群功能分析，KEGG功能分析結(jié)果顯示：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基酸相關(guān)酶、氨基糖和核苷酸糖代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝、核糖體和核糖體生物合成等較對(duì)照組豐富。肺微生物群KEGG功能分析表明：氨基酸相關(guān)酶、DNA復(fù)制蛋白、葉酸生物合成、甘氨酸、嘌呤代謝、核黃素代謝、核糖體等在COPD組較對(duì)照組更豐富。QBPF處理后在腸道及肺中均顯著降低 (Fig. 8)。

Fig.8 | 各組間的不同屬的鑒定和代謝途徑的差異

5、腸道和肺部微生物菌群及免疫因子之間的相關(guān)性分析

為探討腸道和肺部微生物菌群的關(guān)系，對(duì)腸道和肺部菌群相對(duì)豐度Top20的優(yōu)勢(shì)菌在屬水平進(jìn)行了相關(guān)性分析。在腸道和肺部中同時(shí)表達(dá)的有9個(gè)菌屬，其中擬桿菌屬、乳酸桿菌屬等菌屬呈負(fù)相關(guān)(P > 0.05)，奈瑟氏菌屬、Alloprevotella等菌屬呈正相關(guān) (P > 0.05)。肺部菌群支原體與Prevotella_9 (P < 0.01)、擬桿菌(P < 0.05)呈正相關(guān)，與腸道菌群普雷沃菌科_NK3B31_組(P < 0.05)、普雷沃菌科_UCG-001(P < 0.01)、脫硫弧菌(P < 0.01)呈負(fù)相關(guān)。腸道菌群的普雷沃菌科_UCG-001與肺菌群的模糊分類群(P < 0.01)和假單胞菌(P < 0.01)呈正相關(guān)。腸道菌群的腸滴蟲與肺菌群的Prevotella_9 (P < 0.01)、乳桿菌 (P < 0.01)、Rikenellaceae_RC9_gut_group (P < 0.01) 呈負(fù)相關(guān) (Fig. 9)。

在腸道菌群和免疫因子之間識(shí)別出顯著相關(guān)性。COPD 組中Lachnoclostridium、Anaerostipes、Methylophilus、Desulfovibrio、Acetatifactor等減少，與肺功能和Treg相關(guān)細(xì)胞因子呈正相關(guān)，但與Th17 / Treg和Th17相關(guān)細(xì)胞因子呈負(fù)相關(guān)。相反，在 COPD 組中富集的菌屬Coprococcus_2、Rikenellaceae_RC9_gut_group、尖帶桿菌、厭氧菌、Prevotella_9等與肺功能和Treg相關(guān)細(xì)胞因子呈負(fù)相關(guān)，但與Th17 / Treg和Th17相關(guān)細(xì)胞因子呈正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明COPD大鼠的免疫原性狀態(tài)與肺功能和腸道菌群之間存在相關(guān)性 (Fig. 9)。

在肺微生物群和免疫因子之間識(shí)別出顯著相關(guān)性。在COPD組中富集的菌屬Acinetobacter、Niastella、Pseudarthrobacter、Sphingomonas、Gemmatimonas、Massilia、Pseudomonas、Prevotella_2等與Th17相關(guān)細(xì)胞因子呈正相關(guān)，但與肺功能和Treg相關(guān)細(xì)胞因子呈負(fù)相關(guān)。COPD 組中豐度較低的菌屬Prevotella_7、Lautropia、摩根菌等與Th17相關(guān)細(xì)胞因子和Th17 / Treg呈負(fù)相關(guān)，而與Treg相關(guān)細(xì)胞因子呈正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，COPD大鼠的免疫原性狀態(tài)與肺功能和肺微生物群之間存在相關(guān)性 (Fig. 9)。

Fig.9 | 腸肺優(yōu)勢(shì)屬相關(guān)性及關(guān)鍵屬與相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性熱圖

研究結(jié)論